表达猪流行性腹泻—轮状病毒的重组伪狂犬病病毒株的构建及部分生物学特性研究

发布时间：2020-09-14 17:45

　　 猪流行性腹泻、猪轮状病毒病与猪伪狂犬病是严重危害养猪业的三种重要传染病,分别由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪轮状病毒(Rotavirus,PoRV)和猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)引起。PEDV和PoRV主要导致仔猪腹泻,PRV则引起母猪繁殖障碍及新生仔猪急性死亡,并伴有呕吐、腹泻、震颤和运动失调等症状。三种病毒常常混合感染导致更大的危害,为了有效预防和控制这三种疾病,研究一种可同时预防这三种疾病的安全、高效的疫苗显得迫切而必须。本项目拟用PoRV VP7和PEDV S基因的免疫优势抗原区域为目标基因,以PRV XJ株作为活载体,同源重组构建表达PEDV S、PoRV VP7的重组伪狂犬病病毒PRV(CM)株,并开展培养特性、遗传稳定性、安全性等生物学特性研究。1 PRV真核转移质粒pEGFP-VP7.S的构建根据已有文献对PEDV S基因和PoRV VP7基因优势抗原表位的研究,结合生物信息学软件分析,参照NCBI上PEDV和PoRV序列分别设计引物S-a/S-b和VP7-a/VP7-b,在引物上下游5’引入合适的酶切位点、保护碱基和柔性肽序列。RT-PCR扩增出部分VP7和S基因作为本研究的候选基因片段,分别克隆至pMD19-T(Simple),构建pMD-VP7、pMD-S克隆质粒。对pMD-VP7、pMD-S克隆质粒进行Kpn I、BamH I双酶切反应,回收目的片段连接转化,构建了重组质粒pMD-VP7.S,对该质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定,表明目的基因片段无碱基的突变和缺失,相应酶切位点和柔性肽序列准确引入。对pEGFP-gI28k真核表达载体和pMD-VP7.S重组质粒用Xho I、Sal I双酶切,回收目的片段,连接转化,构建含有VP7.S融合基因的PRV真核转移质粒pEGFP-VP7.S,对该质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定。2表达PEDV S和PoRV VP7基因的重组伪狂犬病毒PRV(CM)株的构建将PRV真核转移质粒pEGFP-VP7.S和伪狂犬野毒株PRV XJ株共转染至293T细胞,通过同源重组构建了共表达VP7和S基因并且gI、gE毒力基因缺失的重组伪狂犬病毒PRV(CM)株,经过PCR、Western-Blotting等鉴定,结果表明VP7和S基因成功表达,重组病毒构建成功。3 PRV(CM)株部分生物学特性研究通过将PRV(CM)接种到BHK-21细胞上,增值特性观察发现VP7.S融合基因片段的插入不影响重组病毒株的增值,测定PRV(CM)的TCID_(50)和亲本株相比较,重组病毒株的增值滴度略有降低;一步生长曲线显示重组病毒株和亲本株具有相似的生长动力学;将PRV(CM)在BHK-21细胞传至20代,各代次病毒增殖规律相似;PCR测定显示外源基因稳定存在,毒力基因稳定缺失;安全性试验结果表明,以不同病毒滴度的PRV(CM)接种哺乳仔猪和怀孕母猪,无临床异常是安全的。
【学位单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.651
【部分图文】：

图 1：轮状病毒病毒体的示意图[96]Fig 1: Schematic diagram of rotavirus virions的主要抗原蛋白结构蛋白 VP4、VP6、VP7 是目前公认的和免疫相关的P6，中和抗原 VP7，血凝素抗原 VP4[6]。体存在，在细胞粘附和膜渗透中发挥作用，所以也叫黏酶可将 VP4 在第 241 或第 247 个氨基酸残基处将其裂胰蛋白酶顶端 VP8*的凝集素球状样结构域（65aa-224*的β-桶状结构域（264 aa -474 aa），各占“身体”两边的位长繁殖能力。前人针对 VP4 的中和抗体水平做了大量的病毒还是牛轮状病毒，VP8*都包含了主要的抗原决定位优于 VP5 蛋白的，在鸡身上，VP8*也是优于 VP6 的，但

表 2-6 pEGFP-gI28k 质粒的酶切体系ble 2-6 Enzyme digestion of pEGFP-gI28k pla试剂 用量kCut Buffer 5 μLho I 1 μLSal I 1 μLdH2O 39 μL7.S 质粒 DNA 4 μLotal 50 μL PoRV VP7 基因的扩增结果PoRV SC-R 株分别进行 S 基因和 VP7预期片段大小一致的约 1028bp 和 101

2-2 pMD-VP7、pMD-S 菌液 PCR 鉴 PCR identification results of pMD-VP因的PCR产物；2：阴性对照；3：VP product of S gene; 2: negative controlnegative control-S 克隆质粒的序列测定-VP7、pMD-S 质粒送生工生物，目的基因片段扩增长度和预期 Linker 序列正确引入，为后续的结果见附录 1。原参数分析n 软件分析测序结果的 S 基因和

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本文编号：2818469