热灭活枯草芽孢杆菌对小鼠免疫机能影响的研究

发布时间：2020-09-14 20:08

　　益生菌具有多种生物学功能,被广泛应用于食品、医学、保健等领域。目前国内有关益生菌生物活性的研究主要限于活菌,而在灭活益生菌方面的研究鲜有报道。已有研究发现,益生菌活菌或死菌体均有多种相似的生理功能,灭活益生菌在安全性、贮藏、维持微环境菌群平衡等方面具有较大的优势。本试验首先对购得的一株枯草芽孢杆菌进行培养鉴定,然后选取SPF昆明种小鼠作为试验动物,设置高(1.0×10~8CFU/mL)、中(1.0×10~7CFU/mL)、低(1.0×10~6CFU/mL)剂量灭活菌组(IVC)和活菌对照组(VC)(1.0×10~7CFU/mL)、空白对照组(BC)分别灌服试验小鼠,研究热灭活枯草芽孢杆菌对小鼠免疫指标的影响,主要的试验结果如下:1.试验菌种的培养和鉴定。将购得的试验菌种增殖培养,制作细菌生长曲线。观察菌落和菌体形态特征,测定细菌16S rDNA序列并对细菌进行种属鉴定。结果显示,试验菌种最佳培养时间为10-14 h,其形态学观察符合枯草芽孢杆菌形态学特点;试验菌的16S rDNA扩增序列与标准菌株Bacillus(ID:KY283146.1)序列相似度为100%,确定试验菌种为枯草芽孢杆菌。2.热灭活枯草芽孢杆菌安全性评价。使用生化分析仪检测各试验组血清ALT、BUN、CREA的含量。制作小肠组织切片,观察各组小肠黏膜结构的完整性。结果显示,各试验组和对照组血清生化指标均无明显的差异;低倍视野中各组小肠壁分层清晰,上皮黏膜结构清晰,无炎性细胞浸润,小肠绒毛结构完整,固有层细胞排列紧密,这表明热灭活枯草芽孢杆菌具有较高的安全性。3.热灭活枯草芽孢杆菌对小鼠免疫指标的影响。将40只小鼠随机分为10组,按照0.3mL/只/d的剂量,试验组和活菌组分别灌服高、中、低剂量灭活枯草芽孢杆菌和中剂量活菌,空白对照组灌服LB肉汤,于灌服7 d和14 d后检测各项免疫指标:(1)小肠黏膜阳性IgA细胞数和表达强度评分。采用免疫组化法检测各组小肠黏膜中阳性IgA细胞数和表达强度。结果显示,灌胃7 d和14 d后IVC各组H-score评分均高于BC组,且以IVC中剂量组最高。这表明热灭活枯草芽孢杆菌能增强小鼠机体肠道黏膜反应,以中剂量效果最显著。(2)脾指数测定。称量各组小鼠体重,常规眼球采血后处死小鼠,无菌取脾,记录各组脾重量。结果显示,灌胃7 d后,IVC中剂量组脾指数显著高于其余各组(P0.05);灌胃14 d后,IVC各组脾指数均高于BC组,但差异不显著(P0.05)。这表明热灭活枯草芽孢杆菌能提高小鼠脾指数,且以中剂量效果最显著。(3)全血淋巴细胞、中性粒细胞含量测定。使用血球分析仪检测各试验组全血样本的淋巴细胞和中性粒细胞数目。结果显示,灌胃7 d和14 d后,IVC中、高剂量组全血淋巴细胞和中性粒细胞数目均高于VC组和BC组,且IVC高剂量组显著高于BC组(P0.05)。这表明热灭活枯草芽孢杆菌能提高小鼠血液淋巴细胞和中性粒细胞的数量,且高剂量效果最为显著。(4)IL-2、IL-6、IFN-γ等血清细胞因子含量测定。采用酶联免疫吸附法(ELISA)进行测定。结果显示,灌胃7 d和14 d后,IVC各组血清细胞因子含量均高于BC组,且除IFN-γ外IVC高剂量组显著高于BC组(P0.05)。这表明热灭活枯草芽孢杆菌能显著提高小鼠血清IL-2、IL-6、IFN-γ等3种细胞因子的含量,且在高剂量时效果显著。(5)IL-2 mRNA相对表达量。使用RNA提取试剂盒提取总RNA,并其反转录成cDNA,然后扩增样本cDNA,记录体系中荧光信号达到阈值时的循环次数(Ct值),并以β-Actin作为内参校准IL-2的相对表达量。结果显示,灌胃7 d和14 d后,以BC组为准,IVC中、高剂量组IL-2 mRNA相对表达量均有所上调,这与血清IL-2含量的检测结果基本符合。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S859.797
【部分图文】：

生长曲线,试验菌种,生长曲线,菌种培养

热灭活枯草芽孢杆菌对小鼠免疫机能影响的研究分析菌种培养及鉴定菌种生长曲线菌液波长 600 nm 处的 OD 值，绘制生长曲线（图 1）。图中显示间为 10 -14 h。

菌体形态,试验菌,菌体形态,形态学特点

试验菌菌体形态观察（1000X）

菌落形态,试验菌,菌落形态,菌种

图 2 试验菌菌体形态观察（1000X）图 3 试验菌菌落形态观察ig 2 The observation of the test bacteria(1000X) Fig 3 The observation of colony morphology of the tes验菌种 16S rDNA 鉴定紫外光凝胶成像仪分析凝胶，与对照条带相比，目标扩增产物片段长度约)。测序结果与 Genbank 中已知序列比对，与 Bacillus 标准菌株 (KY28 100%（图 5），确定试验菌种为枯草芽孢杆菌。

【参考文献】