鸭主要病原菌耐药性分析及噬菌体的分离鉴定

发布时间：2020-09-16 12:03

　　鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)、大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)和沙门氏菌(Salmonella enteriditis,SE)是严重危害养鸭业发展的细菌性疾病,能导致鸭大批死亡,造成巨大经济损失。本研究针对生产上鸭常发病原菌RA、E.coli、Pm和SE进行多重PCR检测技术研究,为鸭四种病原菌的混合感染和鉴别诊断提供技术支撑。药物治疗是应对细菌性疾病的主要措施,由于抗菌药物滥用,导致细菌耐药性增加,对鸭场发病鸭进行病原菌分离鉴定,并对分离菌进行耐药表型、耐药基因检测,掌握分离菌耐药状况,为临床用药提供科学指导。食品动物无抗养殖,亟待寻找抗生素的替代品,噬菌体被广泛关注。以鸭RA、E.coli、Pm和SE为宿主菌,进行噬菌体分离鉴定及生物学特性研究,为噬菌体的研发、应用奠定基础。1.鉴别鸭源四种常见病原菌多重PCR方法的建立及应用参考GenBank中SE inv A基因序列、RA Omp A基因序列、Pm kmt1基序列和E.coli Pho A基因序列,分别设计4对特异性引物,提取四种细菌DNA,优化引物浓度与退火温度,建立了多重PCR方法,且进行了特异性、敏感性和重复性试验,并应用于临床样本检测。结果:设计的4对引物能分别扩增出与预期大小相符的目的片段;扩增SE inv A基因片段、RA Omp A基因片段、Pm kmt1基片段和E.coli Pho A基因片段大小分别为830 bp、664 bp、456 bp和261 bp,与参考基因的同源性分别为98.98%、99.68%、98.76%和98.33%;优化引物浓度为SE inv A0.25μmol/L、RA ompA 0.2μmol/L、Pm kmt1 0.15μmol/L和E.coli phoA 0.2μmol/L;退火温度为51.4℃;多重PCR方法仅能扩增出沙门氏菌、鸭疫里默式杆菌、巴氏杆菌和大肠杆菌的特异性条带,而对葡萄球菌、鸭瘟病毒、番鸭细小病毒和鹅细小病毒的核酸扩增结果均为阴性;可检测到SE 8.6 pg、RA 4.4 pg、Pm 6.0pg和E.coli 10 pg;58份临床病料核酸样本中检测出RA 12.07%(7/58),E.coli12.07%(7/58),SE+RA双阳性3.45%(2/58),RA+E.coli核酸双阳性6.90%(4/58),Pm+E.coli核酸双阳性5.18%(3/58)。表明建立的SE-RA-Pm-E.coli多重PCR方法具有特异性强,敏感性高、快速简便等特点,可应用于RA、E.coli、Pm和SE临床感染病例的联合检测与鉴别诊断。2.鸭致病菌分离鉴定及耐药性分析采集临床病料进行病原菌的分离培养,经形态观察、生化鉴定、PCR检测和动物感染试验对分离菌进行鉴定;采用K-B纸片法对分离菌进行20种抗菌药物的敏感性试验,PCR方法对分离菌进行氨基糖苷类、β-内酰胺类、喹诺酮类以及大环内酯类抗菌药物共16种耐药基因进行检测。结果:分离出6株菌落光滑湿润、微隆起、边缘整齐、呈半透明状,染色见两端顿圆的革兰氏阴性短小杆菌;6株分离菌氧化酶和触酶试验均为阳性,且均可分解尿素,不发酵乳糖和麦芽糖,部分菌株可发酵葡萄糖(1/3)和蔗糖(1/6),甘露醇、甲基红试验、VP试验、硫化氢产生、硝酸盐还原和枸橼酸盐试验均为阴性,不水解赖氨酸;SE-RA-Pm-E.coli多重PCR检测出RA特异性条带,PCR扩增细菌16S rRNA基因,扩增产物测序结果与NCBI上公布的鸭疫里默氏杆菌的同源性均在98%以上;分离菌株感染雏鸭致死率100%(18/18),可确定6株分离菌均为致病性的鸭疫里默氏杆菌,命名为RA-SS1(2018)、RA-SS2(2018)、RA-SS3(2018)、RA-SS4(2018)、RA-SS5(2018)、RA-SS6(2018);在选择的20种抗菌药物中,RA-SS1对氧氟沙星和磺胺异恶唑敏感,RA-SS2对头孢氨苄和磺胺异恶唑敏感,RA-SS3对头孢氨苄敏感,RA-SS4对青霉素、氧氟沙星、头孢他啶、头孢曲松、头孢氨苄、磺胺异恶唑和利福平敏感,RA-SS5对头孢氨苄和利福平敏感,RA-SS6对头孢他啶、头孢氨苄和利福平敏感;在选择的16种耐药基因中RA-SS1检测出aac(6’)-Ib、aph(3’)-IIa、rmt C、qnr B、oqx A、oqx B和erm F基因,RA-SS2检测出aac(6’)-Ib、aph(3’)-IIa、rmt C、qnr A、oqx A、oqx B和erm F基因,RA-SS3检测出rmt C、β-DHA、oqx A、oqx B和erm F基因,RA-SS4检测出aph(3’)-IIa、rmt C、β-OXA、qnr B、oqx A、oqx B和erm F基因,RA-SS5检测出aph(3’)-IIa、qnr B、oqx A、oqx B和erm F基因;RA-SS6检测出aac(6’)-Ib、aph(3’)-IIa、rmt C、oqx A、oqx B和erm F基因。3.鸭主要病原菌噬菌体分离鉴定及生物学特性研究分别以沙门氏菌、大肠杆菌、巴氏杆菌和鸭疫里默氏杆菌为宿主菌,采集养殖场污水、粪便和垫料样品,采用双层琼脂平板法分离噬菌体,电镜观察噬菌体形态,并对噬菌体的宿主谱、效价、温度和pH稳定性、最佳感染复数、一步生长曲线及体外抑菌效果等生物学特性进行研究。结果:在沙门氏菌为宿主菌的双层琼脂平板上可见边缘整齐、直径约为1~2 mm的透明噬菌斑,而以E.coli、Pm和RA为宿主菌的双层琼脂平板未见噬菌斑;电镜观察噬菌体呈蝌蚪状,头部平面呈六边形,直径约100 nm,尾部长约125 nm,直径约20 nm,分离噬菌体命名为Bp S(Bacteriophage of Salmonella enteriditis,Bp S);测定Bp S效价为1.10×10~100 pfu/mL;Bp S在温度30℃~50℃能保持较高的活性,且30℃活性最高;pH在6~9,Bp S能保持较高活性,且pH值为7时活性最高;最佳感染复数(muhiplieity of infection,MOI)为0.01;Bp S生长潜伏期为20 min,裂解期为70 min,平均裂解量为42 pfu/cell;在3 h内Bp S对SE有较强抑菌作用。结论:本研究成功建立了快速鉴别检测SE、E.coli、Pm和RA的多重PCR方法;从病死鸭体内分离到6株鸭疫里默氏杆菌,对氧氟沙星、头孢曲松、头孢氨苄、磺胺异恶唑和利福平等抗菌药物有较高的敏感性,对阿莫西林、恩诺沙星、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、丁胺卡那、阿奇霉素、红霉素和新霉素抗菌药物具有较强的耐药性;成功分离鉴定1株沙门氏菌噬菌体,并进行了生物学特性研究。
【学位单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.61
【部分图文】：

耐药机制,细菌,钝化酶,细胞膜通透性

细菌会不断的变异与进化，产生相应的耐药性状，从而与抗生素对抗。细菌耐药机制主要有以下４种（图1）（赵勇等，2018；Allen et al.2010）：细胞膜通透性的变化、外排泵、药物靶标位点突变以及产生灭活酶或钝化酶：

PCR扩增,同源性,基因

分别以 4 种细菌 DNA 为模板，进行 PCR 扩增，由图1-1A 可知，各引物均能有效扩增出与预期大小相符的目的条带。对 PCR 产物进行测序分析，由图 1-1B 可知，SE invA 基因片段大小为 830 bp，与其参考基因（载录号：M90846.1）的同源性为 98.98%；RAompA 基因片段大小为 664 bp，与其参考基因（载录号：FJ765044.1）的同源性为 99.68%；Pm kmt1 基因片段大小为 456 bp，与其参考基因（载录号：AF016259.1）的同源性为 98.76%；E.coliphoA 基因片段大小为 262 bp，与其参考基因（载录号：M29670.1）的同源性为98.53%。

测序,鸭疫,巴氏杆菌,贵州大学

贵州大学 2019 届硕士研究生学位论文832 bp250 bp500 bp750 bp1 000 bpM 1 2 3 4-2 000 bp100 bp663 bp460 bp261 bp图 1-1A 单一 PCR 扩增结果Figure 1-1A Amplification results of single PCRM：DNA 分子质量标准；-：阴性对照；1：沙门氏菌；2：鸭疫里默式杆菌；3：巴氏杆菌；4：大肠杆菌M：DL 2000 DNAMarker；-：Negative control；1：S. enteriditis；2：R. anatipestifer；3：P. multocida；4： E. colia

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