猪双链RNA受体Toll样受体3（pTLR3）功能分析及其与猪MDA5和RIG-I免疫信号相互关系研究

发布时间：2020-09-17 20:02

　　 天然免疫系统的作用机制是依靠模式识别受体(PRRs)对病原体相关分子模式(PAMPs)进行识别,从而在病原体识别和保护性免疫应答启动中发挥关键作用,有助于宿主防御微生物感染。核酸分子包括RNA和DNA是非常重要的PAMPs,对病毒而言更是如此。RNA病毒对人类和动物健康构成严峻的挑战,因此了解RNA受体的免疫生物学对于控制病毒感染至关重要。RNA受体由TLR3,TLR7,TLR8,RIG-I,MDA5,NLRP3,NOD2和其他少数PRRs组成。本研究主要聚焦双链RNA(dsRNA)识别受体猪TLR3(pTLR3),克隆表达pTLR3,鉴定其信号功能;构建pTLR3-NF-κB信号报告细胞系,并用于非洲猪瘟病毒(ASFV)调控蛋白的筛选;重点研究pTLR3和另外dsRNA主要识别受体pRIG-I、pMDA5之间的信号功能关系;最后制备pTLR3单克隆抗体用于下游研究。主要研究内容如下:1.猪TLR3基因的克隆、表达和信号功能鉴定从猪的肺泡巨噬细胞中提取总RNA并使用RT-PCR对猪TLR3基因(pTLR3)进行扩增,,对得到的PCR产物进行纯化后使用SalI和Sma I进行双酶切处理,将酶切产物连接到使用Sal I和及EcoR V进行双酶切的pENTR4-MCS-2HA载体上,构建了中间质粒pENTR4-pTLR3-2HA,序列分析发现猪TLR3开放读码框全长为2737 bp。利用LR位点特异性重组将pTLR3转移到pDEST47载体中,构建含有猪TLR3的真核表达质粒pcDNA pTLR3。将pcDNA pTLR3质粒对HEK293T细胞进行转染并使用Western blotting验证pTLR3是否正确表达。ISRE启动子荧光素酶报告试验中,猪TLR3能够显著地介导配体dsRNA类似物HMW polyI:C刺激引起的下游转录因子IRF3活化,表明pTLR3具有信号功能。2.猪TLR3-NF-KB信号稳定报告细胞系的构建及非洲猪瘟病毒(ASFV)多基因家族(MGF)蛋白的调控作用筛选用实验室已有的293-NF-κB双荧光素酶信号报告细胞系转染pcDNA pTLR3,构建能够稳定表达pTLR3的pTLR3-293-NF-κB信号报告细胞系。该稳定细胞系能够对dsRNA类似物HMW polyI:C刺激产生高效、特异和稳定的应答,因此将这个细胞系用于TLR3-NF-KB信号通路调控因子的筛选。上述pTLR3-NF-κB和实验室已有的人TLR3/RIG-I-ISRE信号报告细胞系同时用来筛选非洲猪瘟病毒(ASFV)基因产物的信号调控作用。ASFV质粒转染报告细胞、不同刺激剂刺激转染报告细胞,应用双荧光素酶(Luciferase)检测试剂检测下游信号并筛选非洲猪瘟病毒基因的调控作用。结果表明,ASFV多基因家族(MGF)调控蛋白12L,13L,UK,A276R,A528R能够抑制 pTLR3-NF-KB 和 TLR3-ISRE 细胞信号通路;12L 和 UK 对 RIG-I/MDA5-ISRE 信号有抑制作用;这些ASFV蛋白对IFN-ISRE信号没有显著影响。ASFV结构相关蛋白P30,P54 能显著地抑制 pTLR3-NF-κB 活性,但是对 pTLR3-ISRE、RIG-I/MDA5-ISRE 和IFN-ISRE信号没有显著影响。重要的是,我们发现P30,P54的细胞毒性非常明显。P54是ASFV内膜蛋白,细胞凋亡功能已经报道,P30的细胞毒性作用还没有报道,值得进一步研究。3.猪TLR3与MDA5、RIG-I的免疫信号功能相互关系研究利用CRISPR-CAS9技术设计pTLR3的gRNA,构建gRNA表达慢病毒,慢病毒感染PAM和PK15。使用嘌呤霉素对pTLR3基因敲除稳定细胞进行了筛选,并同样获得了pTLR3 KO PAM 和 pTLR3 KO PK15 细胞,上述细胞分别用 HMW/LMW polyI:C、EMCV、VSV、SeV刺激并检测下游基因表达。定量RT-PCR结果表明TLR3敲除能增强LMWpolyI:C、EMCV、VSV、SeV刺激RIG-I/MDA5下游基因的表达,提示pTLR3信号能抑制pRIG-I/MDA5信号。同时利用我们实验室之前构建的pRIG-I KO和MDA5 KOPAM/PK15细胞,HMW polyI:C刺激TLR3下游基因表达都减弱,提示RIG-I和MDA5都能增强TLR3的信号。另一方面,将不同浓度的pTLR3分别和pRIG-I、pMDA5共转染293T细胞,定量RT-PCR和ELAM启动子报告基因试验结果表明pTLR3能抑制RIG-I和MDA5下游的基因表达和NF-κB活性。反之,将不同浓度的pRIG-I、pMDA5分别和pTLR3共转染293T细胞,结果表明pRIG-I和pMDA5都能增强pTLR3下游的基因表达和ISRE启动子活性。MAVS是RIG-I和MDA5下游的信号接头蛋白,不同浓度的pMAVS和pTLR3共转染293T细胞,也能增强pTLR3下游的ISRE启动子活性。这些结果与PAM和PK15基因敲除细胞上实验结果相一致。在此基础上,进一步分析pTLR3、pRIG-I、pMDA5分子结构域对其它分子信号的影响。分别构建 pTLR3 胞外区(pTLR3 ECD)、缺失胞外区(pTLR3 △ECD),pRIG-I/MDA52CARDs 缺失区(pRIG-I△2CARDs、pMDA5△2CARDs)的 pcDNA 真核表达质粒。将不同浓度的 pTLR3 ECD、pTLR3 △ECD 分别和 pRIG-I/MDA5 共转染 293T 细胞,RT-qPCR和ELAM启动子实验结果表明pTLR3 ECD能够抑制pRIG-I和pMDA5下游的基因表达和NF-κB启动子活性。反之,将不同浓度的pRIG-I2CARDs、pRIG-I△2CARDs、pMDA52CARDs、pMDA5 △2CARDs 分别和 pTLR3 共转染 293T 细胞,RT-qPCR 和 ISRE 启动子试验结果表明pRIG-I 2CARDs和pMDA5 2CARD都能增强pTLR3下游基因表达和ISRE启动子活性。以上结果表明pTLR3全长及其ECD能够抑制pRIG-I/pMDA5下游基因表达和NF-κB活性,但pTLR3 △ECD对pRIG-I/pMDA5信号的影响不规律。pRIG-I和pMDA5全长及其2CARDs能增强pTLR3下游基因表达和ISRE活性,而pRIG-I △2CARDs和pMDA5△2CARDs对TLR3活性的影响没有规律。4.猪TLR3单克隆抗体的制备将pENTR4-pTLR3中间质粒LR位点特异重组到pDest527-cDNA载体中,构建含有pTLR3的原核表达质粒。经诱导表达,并确定包涵体表达量最高时的IPTG诱导浓度为1mM、温度为37℃、时间2h。在此条件下进行大量摇菌并进行蛋白纯化,纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,获取脾细胞并与骨髓瘤细胞进行融合,使用有限稀释法对ELISA 阳性杂交瘤细胞做三次稀释处理,最终获得可以稳定分泌pTLR3特异性抗体的细胞株,效价可达1:102400。该抗体在Western-blotting中可以特异识别内源性蛋白。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.4
【部分图文】：

２ｋｂＢ＾Ｈ逡逑图１－１猪ＴＬＲ３基因的ＰＣＲ扩增逦图１－２重组质粒ｐＥＮＴＲ４－ｐＴＬＲ３酶切鉴定逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｏｒｃｉｎｅ邋ＴＬＲ３邋ｇｅｎｅ逦Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｅｎｚｙｍｅ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｐＥＮＴＲ４－ｐＴＬＲ３逡逑Ｍ：邋ＤＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ逦Ｍ：邋ＤＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ逡逑１，２，邋３，邋４：邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｏｆ邋ｐｏｒｃｉｎｅ邋ＴＬＲ３逦１，２：邋Ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｐｏｒｃｉｎｅ邋ＴＬＲ３邋ｄｉｇｅｓｔｅｄ邋ｂｙ邋Ｓａｌ邋Ｉ邋ａｎｄ邋Ｓｍａ邋Ｉ逡逑２．２重组质粒ｐＥＮＴＲ４－ｐＴＬＲ３－２ＨＡ的构建逡逑ｐＴＬＲ３邋ＰＣＲ产物经纯化后进行制Ｉ邋ａｎｄ邋Ｉ双酶切，同时中间载体ｐＥＮＴＲ４－２ＨＡ逡逑用５Ｗ邋Ｉ邋ａｎｄ及Ｖ双酶切。酶切产物胶回收的ｐＴＬＲ３与穿梭载体ｐＥＮＴＲ４－２ＨＡ连接，逡逑构建重组中间质粒ｐＥＮＴＲ４－ｐＴＬＲ３－２ＨＡ。挑取单个菌落培养后，提取质粒并进行酶切鉴逡逑定（５＞？0１和５ＷＩ邋），酶切ｐＥＮＴＲ４－ｐＴＬＲ３的条带大小５．１ｋｂ，符合预期（如图１－２）；逡逑测序结果也表明中间质粒构建成功。逡逑２．３邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔｔｉｎｇ邋鉴定邋ｐＴＬＲ３邋的表达逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔｔｉｎｇ结果表明，抗ＨＡ抗体能够识别＆１２０ＫＤ位置的特异性的条带，而空

Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐＴＬＲ３邋ｉｎ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋２９３Ｔ邋ｃｅｌｌｓ逡逑质结构域预测逡逑站中Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋Ｄｏｍａｉｎｓ的ＣＤ－ｓｅａｒｃｈ在线应用预测猪ＴＬＲ３具有典型的ＴＬＲ结构域特征，分别由Ｎ端的含有２２ＬＲＲＣＴ、跨膜区以及胞质ＴＩＲ结构域组成（图１－４）。逡逑５００逦１０００逦１５００逦２０００逦２５００Ｉ邋Ｉ邋！邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋ｆｆＨｔｉＭａｉａａａｉａＢＨｉａＢＢＢａｉＢＭｉＢｉｉｉａａｉｉｉｉｉｉａＢｉＢａａａｉＨＭＨｌ？ｗｃｉｎ？－ｒｉｃｈ邋ｒｅｐｅａｔ邋＜：逦一）邋ｌｗｃｉｎｅ寸ｉｃｈ逦ｋ？ｃｉｎ？－ｒｉｃｈ邋ｒｅｐｅａｔ逡逑ａｔ邋0逦ｌｃｕｃｉｈ？－ｒｉｃｈ逦ｋｕｃｉｎｃ－ｒｉｃｈ邋ｒ４ｐＭｉ0邋ｌｅｕｃｉｎ？＿ｒｉｃｈ邋ｒ＾ｐＭｔＯ逡逑ｒ？ｐ？ｆｌｉ0邋ｌ？？ｃｉｎ？－ｐｉｃｈ逦ｌ？ｗｃｉｎ＊寸ｉｃｈ邋ｒｔｔｐＭｔ邋0逡逑ｃｈ邋ｒ？ｐｃ＜ｉｉＣＪ邋ｌ？？ｃｉｈｅ－ｒｉｃｈ邋ｒｅｐｅａｔ＾１）邋ｌｅｕｃｉｔｔｔ－ｒｉｃｈ邋ｒｅｐｅａｔ逡逑ｅ－ｒｉｃｈ逦ｌ？ｕｃｉｎ？－ｒｉｃｈ邋ｒｅｐｅａｔ邋0邋ｌｅｕｃｉｎ？－ｒｉｃｈ逡逑ｃｉｈ４－ｒｉｃｈ逦？＞逦Ｕｗｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ逡逑ｌｗｃｉｎｔ－ｒｉｃｈ邋ｒｅｐｅａｔ逦ｌ？？ｃｉｎｔ－ｒｉｃｈ邋ｒ？ｐｅａｉ＜＾逡逑ｋｕｃｉｒｉｆｔ－ｒｉｃｈ邋ｒｅｐｗｔ＾逡逑x5：ｍ彳逦ｔｉｒｊ邋：＾ＩＰＫＲ．Ｃ２ｉ逡逑

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本文编号：2821163