PEDV感染仔猪小肠黏膜组织RNA-Seq分析和机体TLRs分布特征

发布时间：2020-09-18 09:39

　　猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)引起的一种能够导致小肠绒毛萎缩脱落而使肠道功能受损的急性传染病,给规模养猪业的稳步发展造成了严重的阻滞。2010年以来,变异的PEDV毒株出现并流行,使得现有疫苗的临床免疫效果并不理想,为了能够高效的控制PED的发生,有必要深入探索PEDV的分子致病机制。伴随高通量测序技术的快速发展,测序后的数据在PEDV感染仔猪肠道的研究中发掘出更多的功能基因,不仅对PEDV的感染机制研究有重要意义,同时也为仔猪肠道免疫应答等功能基因组学的研究提供了新的思维与方法。(1)采用10 mL实验室分离保存的PEDV病毒液经口感染6头无PEDV感染的3日龄健康仔猪,4头对照组仔猪口服10 mL PBS缓冲溶液,发病后6 h采集两组仔猪小肠粘膜组织进行转录组学分析。(2)研究PEDV感染宿主后致病机制和宿主免疫应答相关信息。通过使用高通量测序技术分析宿主感染PEDV后小肠黏膜基因表达差异,了解PEDV与宿主之间的相互作用。通过建立PEDV感染仔猪的模型,采集两组仔猪小肠黏膜组织共计10份,使用BGISEQ-500测序平台进行全基因转录组测序。结果显示,单个样品平均输出6.55 Gb数据;转录本重新组装后获得了65525000多个clean reads和74222000多个raw reads,样品比较基因组的平均对比率为93.55%,比对基因集的平均比对率为75.76%;共检出基因总数为22605,其中已知的基因为22248个,检测到的新基因为371个;共检测出20894个新转录本,其中17864个属于已知蛋白编码基因的新的可变剪接亚型,371个属于新的蛋白编码基因的转录本,剩下的2659个属于长链非编码RNA。这些基因中有3168个基因表达上调,3876个基因表达下调。研究转录组测序中差异表达基因的GO功能显著性富集分析。通过从分子功能、细胞组分和生物过程三大功能类别对差异表达基因进行分析。结果显示,显著富集的GO条目大多与细胞间和细胞内的信号转导、酶活化以及生物代谢相关。通过对差异表达基因的KEGG通路分析,差异表达基因在代谢通路、PI3K-Akt信号通路、癌症信号通路和粘附斑等这4个通路中显著富集。我们发现这些差异表达基因主要参与了机体的代谢过程、信号转导和粘附等,进一步推测这些差异表达的基因可能参与PEDV感染猪小肠黏膜后调控机体免疫应答和细胞凋亡。研究验证转录组测序结果的可靠性。本实验选取GAPDH为内参基因,以PEDV感染后的仔猪肠道黏膜组织和健康仔猪肠道黏膜组织为样本,从转录组测序数据中挑选28个生物意义相关的差异表达的基因,设计引物并进行qRT-PCR实验。结果显示,与转录组测序结果基本一致。(3)研究PEDV感染仔猪后各组织脏器中的带毒情况。通过对实验组仔猪的心脏、肺脏、脾脏、唾液腺等组织进行PEDV的RT-PCR检测。结果显示,从实验组仔猪的肠道、肠系膜淋巴结和心脏均能检出,其余脏器均为阴性。且肠道和肠系膜淋巴结检出率为100%,心脏为16.7%。可初步推测PEDV感染机体后可在肠道组织以外的器官分布。(4)研究PEDV感染仔猪后各脏器组织TLR4和TLR6受体基因表达情况。通过荧光定量PCR方法对两组仔猪群的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结组织进行检测。结果显示,TLR4和TLR6含量表达总体处于下降趋势,而在脾脏和肾脏含量较高,且差异显著。预测PEDV感染仔猪后脏器TLR4和TLR6可能参与抗病毒免疫应答。综上所述,本研究对感染PEDV后仔猪小肠黏膜组织进行转录组测序,获得了差异基因并就病毒感染相关的基因进行注释分析主要分布在代谢通路和PI3K-Akt信号通路,且对PEDV感染分布和Toll-like受体免疫应答情况进行研究。为初步探索PEDV致病机制和免疫应答提供数据支持,并且为进一步研究PED临床诊断和防控措施提供参考依据。
【学位单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S858.28
【部分图文】：

流程图,转录组,信息分析,流程图

图 1-1 转录组重测序信息分析流程图Figure 1-1 Transcriptome Resequencing analysis pipeline. 转录组测序数据分析通过控制多重配对比较的错误发现率（FDR）校正所有 GO 和 KEGG著性水平，并将具有显著富集值的术语确定为目标。Pvalue ≤ 0.05，|log2Ratio| ≥1 的基因被认为是表达差异显著的基因。差异表达基因的 qRT-PCR 验证.1 引物设计为了验证 RNA-seq 结果的准确性，随机挑选 28 个生物意义相关的基因PCR 分析。使用 Primer premier 5.0 对目标基因进行引物设计（表 1-2已公开的参考基因选择内参照基因（GAPDH）[111]。所有反应设三个重GAPDH（Genbank: 396823）作为内生参考，相对基于此计算每个 D水平比较阈值。表 1-2 qRT-PCR 分析引物

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2 结果染动物实验的结果毒 4 日龄仔猪后，15-20 h 左右出现呕吐症状，呕吐。20-25 h 左右仔猪出现腹泻症状，腹泻物为腥臭味成功感染仔猪。测序结果分析量检测结果Izol 试剂的方法提取的 RNA，进行凝胶电泳，确定抽的污染情况，如图 2-1 所示。结果显示 28S、18S、NA 完整性好（如图 2-2）。使用 Agilent 2100 生化分ano Kit）检查 RNA 完整性 RIN 值均大于 7.0，检测 2 2-2），表明上述提取总 RNA 完整性好，能达到 B具体数据结果如表 2-1。以上结果显示 RNA 样品没可以送测序公司（华大基因）构建文库进行测序。

PEDV感染仔猪小肠黏膜组织RNA-Seq分析和机体TLRs分布特征

TPD1和CPD1Agilent2100检测

【参考文献】