鸡IL-2与IL-4融合基因表达载体的构建、表达及体外生物学活性研究

发布时间：2020-09-19 10:58

　　 为了提高鸡球虫病活疫苗免疫效果,增强免疫保护力,降低活疫苗副作用,缩短免疫产生期,通过以鸡白介素4(chIL-4)和鸡白介素2(chIL-2)为研究对象,构建新型细胞因子免疫佐剂chIL-4和chIL-2融合基因表达载体,研究该融合基因的佐剂作用。试验结果表明:(1)采用基因合成与双酶切连接技术,经测序鉴定成功构建携带鸡白介素4、鸡白介素2以及二者融合基因的重组真核表达载体pCI-chIL-4-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP和pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP。(2)采用HilyMax脂质体介导方法转染小鼠成肌细胞C2C12,对转染条件进行优化,在荧光显微镜下观察,通过IPP软件分析其累计光密度值。结果表明,重组载体pCI-chIL-2-EGFP能在小鼠成肌细胞内正确表达,DNA与Hilymax脂质体比例为1:3时细胞转染率最高(29.65%±2.58%),转染72h后蛋白表达量达到最高。(3)将构建的 pCI-chIL-4-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP 和 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP 三种重组质粒转染鸡胚盲肠上皮细胞、鸡胚成纤维细胞,24h-96hmRNA表达量均先升高后降低,48h极显著(P0.01)高于其他时间段,达到峰值;累积光密度值先升高后降低,72h显著(P0.05)或极显著(P0.01)高于24h和48h,达到峰值,到96h已检测不到;细胞上清液荧光强度先升高后降低,72h极显著(P0.01)高于其余三个时间段,达到峰值。转染小鼠成肌细胞24h-96h,mRNA和蛋白表达量均先升高后降低,mRNA 48h和蛋白72h极显著高于其他时间段,达到峰值;细胞上清液荧光强度先升高后降低,72h极显著(P0.01)高于其余三个时间段,达到峰值,表明三种重组质粒均能在三种细胞中进行表达,并能持续72h以上,三种重组蛋白均能分泌到细胞外,并在72h达峰值。(4)pCI-chIL-4-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP 和 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP 三种重组质粒转染鸡胚盲肠上皮细胞、鸡胚成纤维细胞和小鼠成肌细胞三种细胞24h-96h的上清液均能极显著(P0.01)促进鸡脾淋巴细胞的增殖,刺激指数均先升高后降低,72h达峰值,表明三种重组蛋白都具有生物学活性;而pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP重组质粒转染细胞的上清液对鸡脾淋巴细胞的增殖极显著(P0.01)高于另外两种重组质粒,表明chIL-4-chIL-2融合蛋白的生物学活性显著高于chIL-4重组蛋白或chIL-2重组蛋白。
【学位单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S858.31
【部分图文】：

图５邋ｐＣＩ－ｃｈＩＬ－２－ＥＧＦＰ质粒测序峰图逡逑－３２－逡逑

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