甲型H1N1、H3N2流感病毒在MDCK细胞系上的增殖特性研究

发布时间：2020-09-19 17:35

　　 目前动物细胞生物反应器大规模培养技术被广泛应用于病毒类疫苗的生产中。国外应用该技术生产的流感病毒细胞疫苗已通过安全认证并在临床上得到广泛使用。而我国的流感疫苗生产仍以落后的鸡胚工艺为主。鸡胚苗因其生产存在劳动强度大、效率低、批量小、易污染、成本高,发病时还可能出现SPF鸡胚供应不足、应急能力差等缺陷,在生产实践中已日趋淘汰。为了提高流感疫苗的产量、质量和市场竞争力,尽快开发生物反应器大规模培养动物细胞生产流感病毒细胞苗的工艺技术,成为我国疫苗生产企业急待攻克的技术难关。当前,疫苗企业在开发流感细胞疫苗中发现,在大规模培养的动物细胞内,流感病毒增殖效率较低,不能在短时间内达到配制疫苗所要求的病毒滴度,限制了流感病毒细胞苗的开发速度。据报道犬肾来源的MDCK细胞对流感病毒敏感,在兽用疫苗生产中已得到应用。本文通过将两株甲型H1N1和H3N2流感病毒疫苗毒毒株,分别在SPF鸡胚中增殖、扩增,构建工作种毒库,进行了生物学鉴定。然后在MDCK贴壁细胞和悬浮细胞上进行培养、增殖适应与传代驯化,探索了两株流感病毒在MDCK细胞系上的培养、增殖条件与规律,确定了最佳病毒感染复数(MOI)、最佳接毒与收毒时间,提高了两株流感病毒在MDCK贴壁细胞和悬浮细胞上增殖后的血凝效价(HA)和病毒滴度(CCID_(50))。其中甲型H1N1株在MDCK贴壁细胞和悬浮细胞中增殖时,其HA均可达到2~8HA units/25μl;CCID_(50)分别可达到7.50TU/ml和7.32TU/ml;甲型H3N2在两种MDCK细胞中复制,所得毒液的HA略低于H1N1,最高可达2~7HA units/25μl,CCID_(50)最高分别可达7.12 TU/ml和6.79TU/ml,能够满足疫苗生产对抗原含量的要求。最后,根据优化后的病毒培养条件参数,分别将两株病毒在MDCK贴壁细胞和悬浮细胞上培养、扩增,然后收毒、冻存,进行生物学鉴定,建立了两株病毒的细胞毒工作代毒库和种子毒毒库,为后续利用生物反应器培养MDCK细胞生产流感病毒细胞疫苗,奠定了病毒基础,对以MDCK细胞为培养基质的流感病毒细胞疫苗的开发与生产具有重要意义。
【学位单位】：西北民族大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

同时发现，在甲型流感病毒表面除了血凝素和神经氨酸酶外，还存在量较少的跨膜蛋白离子通道蛋白。经研究发现其中基质蛋白是流感病毒中多的蛋白，它位于病毒粒子双层脂质膜的下边，构成了病毒包膜的框架[17HA 由 RNA4 编码,含 HA1 和 HA2 两个亚单位，负责病毒与宿主细胞表液酸受体结合并进入宿主细胞，NA 由 RNA6 编码，它与新产生的病毒从的细胞中释放出来的过程有关[17]。一个成熟的病毒颗粒结构可分三层，为双层类脂囊膜，它来自宿主细胞，囊膜上散布着形态不一的蛋白突起，似三角形的细长棒，是凝集红细胞的血球凝集素 HA；另一种呈蘑菇状，毒颗粒从凝集的红细胞表面释放出来的神经氨酸酶 NA，HA 和 NA 在囊例约 4：1；还有一种突起为膜蛋白 M2，三种突起均插入类脂膜并以疏水酸为锚固定在类脂膜，与基质蛋白 M1 相接触。类脂囊膜下面的中间层1 构成的单分子或若干分子厚的球形蛋白壳。最里层是裹在球形蛋白壳中体，呈螺旋对称[33]。甲型流感病毒具体结构见图 1。

西北民族大学生命科学与工程学院 2019 届硕士研究生学位论文（续表）毒种 细胞接种密度 HA CCID50甲型H3N2 X-263B1.0×104cells/cm2265.121.5×104cells/cm2266.852.0×104cells/cm2277.003.0×104cells/cm2276.90

西北民族大学生命科学与工程学院 2019 届硕士研究生学位论文（续表）毒种 细胞接种密度 HA CCID50甲型H3N2 X-263B1.0×104cells/cm2265.121.5×104cells/cm2266.852.0×104cells/cm2277.003.0×104cells/cm2276.90

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 蔡立英;;预防流感大流行[J];世界科学;2014年05期

2 杨颜慈;郭斌;殷红;;无血清培养基的成分改进及应用现状[J];生物学杂志;2013年01期

3 张韧;王建超;陈文庆;刘华杰;高飞;徐舸辰;林龙飞;;反应器细胞悬浮培养和微载体培养技术在动物疫苗生产中的应用[J];中国兽药杂志;2012年11期

4 熊成龙;张志杰;梁笛;蒋露芳;陆一涵;居丽雯;陈跃;姜庆五;;甲型流感病毒血凝素基因的进化与分型研究[J];复旦学报(医学版);2011年04期

5 吴欢欢;李玉苹;;甲型H1N1流行性感冒重症与危重症患者临床特征分析[J];医学研究杂志;2011年04期

6 钟莹;;从甲型H1N1流感病毒事件看我国突发公共卫生事件的信息发布[J];首都医药;2010年18期

7 李春艳;肖晶;李曦;刘娣;;微载体规模化培养MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的研究[J];中国人兽共患病学报;2009年12期

8 杜宁;王大燕;舒跃龙;;2009新甲型H1N1流感病毒病原学概述[J];病毒学报;2009年06期

9 李颖;;甲流病毒主要通过飞沫传播[J];中国社区医师(医学专业半月刊);2009年18期

10 雷达;艾立新;邓红樱;丁国允;;流感大流行特征启示甲型H1N1流感防控策略[J];中国国境卫生检疫杂志;2009年03期

相关博士学位论文 前5条

1 敬岳;流行性感冒中医证候学特征横断面调查及随访研究[D];北京中医药大学;2017年

2 刘林青;H5N1流感病毒感染孕鼠的机制以及养禽业人员禽流感感染风险调查[D];中国农业大学;2014年

3 程凯慧;H6N1亚型禽流感对哺乳动物的传播与致病机制研究[D];石河子大学;2013年

4 邹镇;H5N1型禽流感病毒和甲型H1N1流感病毒致急性呼吸损伤的机理研究[D];北京协和医学院;2012年

5 陈昊阳;我国重大传染病态势及对国家人口安全影响的研究[D];第三军医大学;2007年

相关硕士学位论文 前4条

1 郑锋玲;甲型H1N1流感患者中医临床症状分析与温病患者相关指标研究[D];广州中医药大学;2016年

2 邱雨晨;甲型H1N1流感中西医诊疗研究进展概述[D];北京中医药大学;2015年

3 高伟星;甲型H1N1流感亚单位疫苗生产工艺研究[D];吉林大学;2015年

4 姚志东;MDCK细胞培养的甲型H1N1流感病毒疫苗研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年

本文编号：2822810