稳定表达gBST-2蛋白Vero细胞系的构建及其对PPRV增殖特性的影响
发布时间：2020-09-24 13:09
小反刍兽疫是由副粘病毒科麻疹病毒属中的小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus,PPRV)引起的,主要感染山羊和绵羊,临床以发热、口炎、腹泻、肺炎等为特征,发病率和死亡率高达90%以上,为农业部一类动物疫病。PPRV是一种具有囊膜的RNA病毒,其复制和出芽机制尚不完全清楚。BST-2作为干扰素诱导表达的天然免疫限制因子,在哺乳动物成熟B细胞、单核细胞、T细胞、巨噬细胞、类浆树突状细胞、巨噬细胞中都有表达。为了研究BST-2在PPRV复制和出芽过程的作用机制,进行了本论文研究。首先,根据GenBank中山羊BST-2的基因序列(登录号:XM_018051380.1)设计了一对特异性引物,以pUC-gBST-2质粒为模板,PCR扩增山羊BST-2基因,并插入到pLOV-GFP-3×Flag载体,构建了重组质粒pLOV-gBST-2。利用钙转染法将重组质粒pLOV-gBST-2、外膜质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2共转染293T细胞,获得一株gBST-2基因重组慢病毒。将含gBST-2基因的重组慢病毒感染Vero细胞,利用嘌呤霉素加压筛选,获得一株稳定表达gBST-2蛋白的细胞系,命名为Vero-gBST-2细胞系。将该细胞系连续传代15代,经过PCR、RT-PCR、Western blot检测表明Vero-gBST-2细胞系能稳定持续表达gBST-2蛋白,gBST-2蛋白主要定位在Vero细胞的细胞膜上。应用PPRV感染Vero-gBST-2细胞系,进一步研究gBST-2蛋白对PPRV增殖特性的影响,绘制PPRV在Vero-gBST-2细胞中的一步生长曲线。结果显示,PPRV在Vero-gBST-2细胞系增殖不佳,病毒滴度降低,gBST-2蛋白能明显地限制PPRV复制。PPRV感染后48h、72h、96h收取的细胞进行Western blot检测,发现感染的Vero-gBST-2细胞中病毒粒子的产量减少。结果初步表明,gBST-2蛋白能限制PPRV的复制和出芽。应用激光共聚焦检测发现,gBST-2蛋白与PPRV存在共定位。综上所述,本研究构建的Vero-gBST-2细胞系能稳定持续表达gBST-2蛋白,gBST-2蛋白能够限制PPRV的增殖。研究结果为探究PPRV的致病机制以及宿主对抗病毒感染天然免疫提供了平台。
【学位单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：
PPRV 基因组全长为 15948nt[15]，在麻疹病毒属中基因组是最长的，并且 PPRV基因组满足六碱基原则，这保证了病毒基因组的复制效率[16]。PPRV 基因组包含 6 个基因，它们按序排列分别为 3’-N、P、M、F、H、L-5’，分别编码出 6 个蛋白，依次是核衣壳蛋白（Nucleoprotein, N）、磷蛋白（Phosphoprotein, P）、基质蛋白（Matrix proteiM）、融合蛋白（Fusion glycoprotein, F）、血凝蛋白（Haemagglutinin glycoprotein, H）和大蛋白（ Large protein, L）[17]。P 基因在转录过程中，mRNA 进行编辑，编码产生P 蛋白以及两个非结构蛋白 C 蛋白和 V 蛋白。图 1-1 PPRV 病毒粒子结构示意图Fig.1-1 The schematic diagram of Peste despetits ruminants virusFig.1-2 Electron microscope of Peste des petits ruminantsvirus nucloapsid in the cytoplasm of an infected cell图 1-2 被感染细胞的细胞质中 PPRV 核衣壳电镜图
PPRV 基因组全长为 15948nt[15]，在麻疹病毒属中基因组是最长的，并且 P组满足六碱基原则，这保证了病毒基因组的复制效率[16]。PPRV 基因组包含 Fig.1-1 The schematic diagram of Peste despetits ruminants virusFig.1-2 Electron microscope of Peste des petits ruminanvirus nucloapsid in the cytoplasm of an infected cell
和 pLOV-GFP-3×Flag 载体分别用 Not I 和 Nhe I 双酶切后过夜的连接产物转化至 Trans5α 感受态细胞中，菌 阳性质粒，重组质粒经 Not I 和 Nhe I 酶切鉴定正确（图-2 基因序列比对一致，表明重组质粒 pLOV-gBST-2 构建M 1M 1 2
本文编号：2825764
【学位单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：
PPRV 基因组全长为 15948nt[15]，在麻疹病毒属中基因组是最长的，并且 PPRV基因组满足六碱基原则，这保证了病毒基因组的复制效率[16]。PPRV 基因组包含 6 个基因，它们按序排列分别为 3’-N、P、M、F、H、L-5’，分别编码出 6 个蛋白，依次是核衣壳蛋白（Nucleoprotein, N）、磷蛋白（Phosphoprotein, P）、基质蛋白（Matrix proteiM）、融合蛋白（Fusion glycoprotein, F）、血凝蛋白（Haemagglutinin glycoprotein, H）和大蛋白（ Large protein, L）[17]。P 基因在转录过程中，mRNA 进行编辑，编码产生P 蛋白以及两个非结构蛋白 C 蛋白和 V 蛋白。图 1-1 PPRV 病毒粒子结构示意图Fig.1-1 The schematic diagram of Peste despetits ruminants virusFig.1-2 Electron microscope of Peste des petits ruminantsvirus nucloapsid in the cytoplasm of an infected cell图 1-2 被感染细胞的细胞质中 PPRV 核衣壳电镜图
PPRV 基因组全长为 15948nt[15]，在麻疹病毒属中基因组是最长的，并且 P组满足六碱基原则，这保证了病毒基因组的复制效率[16]。PPRV 基因组包含 Fig.1-1 The schematic diagram of Peste despetits ruminants virusFig.1-2 Electron microscope of Peste des petits ruminanvirus nucloapsid in the cytoplasm of an infected cell
和 pLOV-GFP-3×Flag 载体分别用 Not I 和 Nhe I 双酶切后过夜的连接产物转化至 Trans5α 感受态细胞中，菌 阳性质粒，重组质粒经 Not I 和 Nhe I 酶切鉴定正确（图-2 基因序列比对一致，表明重组质粒 pLOV-gBST-2 构建M 1M 1 2
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 王萍;田玉科;田学愎;程秋菊;陈莎莎;宋珂;罗婷;;慢病毒对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响[J];中华麻醉学杂志;2009年05期
本文编号：2825764
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