貉IgG交叉免疫原性及Fc多肽功能活性研究

发布时间：2020-09-25 17:09

　　 IgG作为连接先天性免疫与获得性免疫的功能分子,是抗原与受体及效应分子相互作用的桥梁,其在血清中含量最高,同时半衰期最长,主要是由脾脏以及淋巴结中的浆细胞合成。与抗原分子特异性结合形成抗原-抗体复合物,改变Fc段的构象,暴露相应的补体结合位点,使得C1q与之结合,进而激活补体系统;此外,IgG可通过其Fc片段特异性识别细胞表面的Fc受体,从而产生多种不同的生物学效应,主要包括:病毒中和作用、ADCC作用、胞外杀伤及免疫炎症、吞噬调理作用等。IgG-Fc段作为抗体分子与细胞及效应分子相互作用的重要结构域,介导细胞免疫应答反应,对抗体自身的抗原性起着决定性作用。IgG重链恒定区尤其是Fc段基因在不同动物间相对保守,因此分析IgG重链Fc基因在不同动物间的同源性,可以更加精确地反映不同动物抗体间交叉免疫原性的差异。本试验选用貉IgG重链为研究对象,研究内容主要分为三部分:第一部分貉IgG重链基因序列测定及分析根据NCBI上已公布的犬、水貂IgG重链基因的保守区域设计引物,从病貉的脾脏内提取RNA。通过Race技术首次成功克隆貉IgG重链全基因,序列全长1474bp,编码491个氨基酸。利用多种软件对其IgG重链基因进行生物信息学分析和遗传进化分析。核苷酸分析结果显示貉与犬IgG间亲缘关系最近,同源性为92.6%,与猫的同源性为83.0%,与水貂的同源性为82.8%,与人的同源性为75.9%,与鼠的同源性为68.2%。氨基酸序列进行比较分析发现,貉与犬同源性为89.6%,与水貂的同源性为77.2%,与人的同源性70%左右,与鼠在60%左右。通过Swiss-model同源建模,对貉、犬IgG三维晶体结构进行预测,得出貉、犬IgG三维结构均基于人类IgG分子建模,立体结构的相似度保持在70%左右。关键氨基酸差别和三维空间结构的不同是IgG的遗传变异所在。第二部分不同种属动物间IgG免疫原交叉性分析不同种属动物的IgG三维立体结构具有较高的相似性,同时其各自Fc段氨基酸残基相对保守,预示了不同动物IgG与不同动物的酶标二抗间存在交叉反应,但其交叉反应强度与IgG-Fc段的结构密切相关。通过dot-ELISA及WesternBlot试验,检测了小鼠、鸡、鸭、人、貉、兔、水貂血清抗体分别与抗犬、抗兔、抗鼠和抗人四种酶标二抗间的交叉反应性,同时分析了貉IgG-Fc融合蛋白与抗犬二抗间的免疫原交叉性。结果表明,不同动物的IgG之间,或多或少都存在一些交叉性。不同纲目之间的动物也可有一定程度的交叉免疫反应,例如鸡与犬二抗间有相对明显的交叉反应,而与兔、鼠、人二抗间几乎不存在免疫交叉。第三部分貉IgG-Fc多肽生物功能活性分析借助文献及在线软件分析貉Fc区功能活性位点,人工合成貉IgG-Fc区多肽NTVSITCLVK(N10K)、PSVYVLPPSQ(P10Q)及阴性对照多肽MSTAVSKCAT(NC),Fc多肽在不同浓度下与小鼠外周血淋巴细胞共培养18h检测上清液中细胞因子含量(TNF-α,IL-1β,IL-6),发现在浓度为10μg/m L时,多肽N10K可以刺激淋巴细胞分泌更多的TNF-α(271.95pg/m L),IL-1β(27.42pg/m L),而多肽P10Q可以促进淋巴细胞产生较多的IL-6(35.51pg/m L)。初步确定貉IgGFc区多肽P10Q及N10K对外周血淋巴细胞的体外免疫诱导功能活性,同时为今后貉源疾病预防及治疗奠定基础,为研究多肽疫苗提供了实验依据。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S858.92
【部分图文】：

免疫球蛋白,结构示意图

山东农业大学硕士学位论文发挥重要作用（Radaevand Sun, 2001a; Radaevson S L, 2004），CH3（或 CH4）能与细胞表面调理吞噬及超敏反应（Bennett J C et al., 1965）G Fc 片段为马蹄形双重对称的二聚体晶体结构构与 Fc 段基本相同，因绞链区的存在，Fab 与得 IgG 呈现不对称性和良好的灵活性。 region）是位于 CH1 和 CH2 之间的 10 到 60 个片段，因其含有大量脯氨基酸残基（Dall’键，阻碍螺旋结构产生，所以有利于免疫球蛋分子不同位置上的表位结合，从而利于补体结感，经蛋白酶处理的 Ig 多在该区裂解。

片段,受体,补体结合,经典途径

图 2 Fc 片段各种效应功能Fig 2 Fc fragments of various effector functions体系统抗原结合形成抗原-抗体复合物后，可因 Fc 片段构象区内的补体结合位点暴露，C1q 的头部可以直接结合IgG结合在CH2区，从而通过经典途径激活补体系统（Sa激活后，可以通过级联反应导致靶细胞溶解；还可通段发挥趋化、促炎等效应。蛋白 Fc 受体生物学特性94 年，第一只 IgG Fc 受体（ FcR）基因敲出小鼠研究体内的生物学功能活性研究取得了巨大进步。作为 IgG，Fc 受体在许多效应细胞以及免疫辅助细胞表面表达胞免疫的桥梁，在免疫细胞和抗原抗体复合物以及其他

示意图,示意图,受体,巨噬细胞

I （CD32）为 40 kDa 左右的跨膜糖蛋白，含有 2 个 Ig 样低亲和力受体,在生理条件下不能结合IgG单体,只能与IgG作为细胞分布最广泛的 Fc 受体，主要存在于单核细胞、胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、血小板、B 细胞、D（Berntzen G.et al., 2009; Flesch et al., 2000），研究发现其基质细胞中也存在表达。RIII（CD16）II（CD16）为 50-80 kDa 的膜糖蛋白，含有 2 个 Ig 样胞外中低亲和力受体（Raghavan et al., 1996）。作为自然杀伤受体，在肥大细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒单核细胞分化的腹腔巨噬细胞和巨噬细胞中表达，但是在达，（Nishio M et al., 2009; Flesch et al., 2000）。

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