重组脂联素对豁眼鹅卵泡颗粒细胞激素分泌功能的影响

发布时间：2020-09-25 14:04

　　脂联素(adiponectin,AdipoQ)作为一种新型的脂肪细胞因子,不仅在调控动物脂代谢方面具有一定影响,在调控动物生殖系统方面也具有一定的作用。目前,AdipoQ在人类、鼠、猪中被大量研究,且取得了可喜可贺的进展。但在禽类中研究还不是很多,且关于AdipoQ对卵巢激素分泌功能的影响的报道甚少。豁眼鹅属地方品种,以优良的产蛋性能著称于世。但近年来,由于杂交不规范,豁眼鹅的产蛋性能出现了退化趋势。本试验通过构建豁眼鹅AdipoQ基因原核表达载体,表达并纯化重组AdipoQ,用重组AdipoQ处理豁眼鹅卵泡颗粒细胞,测定豁眼鹅卵泡颗粒细胞分泌P_4和E_2的水平,检测卵泡颗粒细胞内生殖激素合成分泌相关因子StAR、CYP11A1和CYP19A1的基因和蛋白表达情况,探讨AdipoQ在豁眼鹅卵泡颗粒细胞激素分泌功能方面的可能作用,为进一步研究AdipoQ对豁眼鹅生产性能的影响及其作用机制奠定基础。本试验选取产蛋期(10月龄)豁眼鹅6只,分别采集其卵巢组织,根据GenBank中收录的鸿雁AdipoQ基因序列设计引物,进行豁眼鹅AdipoQ基因CDS序列的扩增,然后将纯化后的AdipoQ目的片段与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-AdipoQ重组质粒。再用EcoRⅠ与XhoⅠ进行双酶切,将目的片段与pET-28a载体连接,构建pET-28a-AdipoQ重组表达质粒,转化E.coli BL21(DE3)基因工程菌进行诱导表达并纯化,最终获得了含有His标签的重组AdipoQ。然后用纯化后的重组AdipoQ(1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL)处理豁眼鹅卵泡颗粒细胞,通过ELISA、qRT-PCR、免疫荧光和Western blot等方法检测豁眼鹅卵泡颗粒细胞中P_4和E_2分泌水平,以及生殖激素合成分泌相关因子StAR、CYP11A1、CYP19A1的mRNA与蛋白表达情况。结果显示,成功构建pET-28a-AdipoQ重组表达载体后,利用其在0.4 mM IPTG、30℃诱导表达6 h的条件下,成功获得重组AdipoQ,并通过镍柱亲和层析的方法成功纯化重组AdipoQ;重组AdipoQ处理豁眼鹅卵泡颗粒细胞24 h后,可使卵泡颗粒细胞P_4分泌量极显著升高(P0.01),E_2分泌量显著降低(P0.05);StAR mRNA和蛋白表达水平极显著升高(P0.01),CYP11A1 mRNA和蛋白表达水平显著升高(P0.05),CYP19A1 mRNA表达水平显著降低(P0.05),其蛋白表达量虽有降低趋势,但变化不明显(P0.05);StAR蛋白和CYP11A1蛋白荧光强度显著增强(P0.05),CYP19A1蛋白荧光强度变化不显著(P0.05)。本试验结果表明,重组AdipoQ对豁眼鹅卵泡颗粒细胞激素分泌功能具有一定影响,既可以通过上调StAR和CYP11A1的表达,促进P_4的合成与分泌,也可以通过下调CYP19A1的表达,抑制E_2的合成与分泌,从而实现对卵巢分泌功能的调控作用。
【学位单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S835
【部分图文】：

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图 1-1 总 RNA 电泳图1 The total RNA by Agarose gel electrop泳对卵巢组织提取的总 RNA 进行带明显，表明提取的总 RNA 较纯度，可用于下一步试验。 PCR 扩增和胶回收R 扩增结果

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图 1-1 总 RNA 电泳图ig.1-1 The total RNA by Agarose gel electrophor电泳对卵巢组织提取的总 RNA 进行检s 条带明显，表明提取的总 RNA 较完整使用纯度，可用于下一步试验。的 PCR 扩增和胶回收 PCR 扩增结果

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图 1-3 胶回收电泳图Fig.1-3 The gel extraction by Agarose gel electrophores注：M：15000DNAMarker；1,2：AdipoQ 基因片段Note：M：15000DNA Marker；1,2：AdipoQ gene segment看出，胶回收后的 AdipoQ 目的片段条带清晰。段的克隆段阳性重组子菌落 PCR 鉴定结果

【参考文献】