单链退火（SSA）介导的动物基因组精确编辑系统的构建、优化及应用

发布时间：2020-09-26 16:54

　　随着测序技术的不断发展,由碱基序列组成的生命画卷逐渐呈现在世人面前。基于日渐完善的基因组序列信息,特定基因的功能研究、遗传疾病的碱基突变检测及畜禽优良性状的基因定位和改良等系列研究也逐步推进。以上研究主要通过基因组编辑技术对靶基因序列实现定点插入、序列删除或碱基突变实现。基因组编辑技术依赖人工特异性核酸酶在基因组上制造双链断裂及由此引发的DNA修复途径实现基因编辑。现阶段两种主要的DNA修复途径导致的编辑结果分为:通过非同源末端链接(Nonhomologous end-joining,NHEJ)修复途径产生碱基插入或缺失造成基因敲除,和通过带有断口两端同源序列的供体DNA参与的同源介导的修复(Homology-directed repair,HDR)途径实现特定碱基序列的插入、删除或替换。在疾病治疗和畜禽性状改良的实际应用中,要求在对基因组序列进行改造的过程中保证基因组编辑的精确性,即除了目的碱基的删除、插入或替换外,不引入任何额外的碱基序列,这一技术被称为基因组精确编辑。目前存在的基因组精确编辑技术根据基因组编辑次数划分,可以分为一步法和两步法。一步法使用核酸酶在基因组上造成双链断裂之后,以环状质粒、双链DNA或者单链DNA为模板,通过HDR直接向基因组中引入点突变、碱基缺失或序列插入。两步法在第一步通过HDR引入点突变、碱基缺失或序列插入的同时,引入用于阳性筛选的整合序列;第二步通过Cre-Loxp、piggyBac或二次HDR的方式,将第一步引入的筛选序列删除,最终得到基因组精确编辑结果。一步法的修复结果只能通过测序对编辑之后的细胞单克隆进行逐个检测,耗时耗力且效率低,因此一般通过药物或者荧光筛选系统,帮助得到核酸酶转染阳性或者核酸酶打靶阳性的克隆,此方法一般用于胚胎干细胞、诱导多能干细胞或者原核注射等试验。而在现存的两步法技术中,Cre-Loxp系统敲出筛选序列之后会在基因组上残留一个Loxp序列,可能导致基因沉默、染色体结构改变等隐患;piggyBac转座子在实现序列高效删除的同时,可能会引起基因组其他TTAA位点处筛选序列随机插入;二次HDR的方法则面临因整合至基因组的筛选基因沉默而导致的假阳性结果。本研究提供了一种新的两步法基因组精确编辑技术——基于单链退火(Single strand annealing,SSA)修复机制的基因组精确编辑技术。该策略的供体DNA包含正、负药物及荧光筛选基因的筛选表达盒序列,和序列两侧同向同源的SSA同源臂序列。该技术第一步依赖CRISPR/Cas9产生双链断裂,经由带有点突变的同源臂介导的HDR,向基因组中带入精确编辑序列的同时,插入筛选表达盒及SSA同源臂序列;第二步靶向筛选表达盒外侧、SSA同源臂内侧的靶位点,造成两个双链断裂,在删除筛选序列同时引发SSA修复机制,完成基因组精确编辑。基于以上理论设计,本研究主要结果如下:1.构建了单链退火(SSA)介导的基因组编辑技术,并利用该系统在293T细胞的CCR5位点、APP位点和α-syn位点分别获得45.83%,68%和50%的精确编辑效率。2.针对基因组编辑系统的第一步HDR供体载体形式和第二步SSA同源臂长度两个方面,对试验一获得系统的效率进行优化,发现双切质粒供体具有更高的整合效率,且基因组上的SSA效率与同源臂长度呈正相关。3.基于试验二优化结果对供体载体进行改良,并利用改良载体在PK15细胞的IGF2位点和RELA位点进行应用,分别获得30%和53.33%的精确编辑效率。4.由于在基于单链退火的基因组精确编辑技术的开发中(试验一、二、三),没有观察到双等位编辑的结果;但在遗传疾病治疗、基因功能研究及畜禽品种改良中,双等位基因编辑具有重要应用价值。故基于试验一、二、三中使用的正负筛选表达盒序列设计原则,进一步开发出了用于双等位基因编辑的TK-Puro~R-eGFP/TK-Zeo~R-mRFP双等位基因敲入系统,且在293T细胞的APP位点和PSEN1位点分别得到52.94%和54.90%的双等位编辑效率。在TK-Puro~R-eGFP/Tk-Zeo~R-mRFP双等位编辑系统基础之上优化筛选表达盒长度,构建了Puro~R-eGFP-TK/Zeo~R-mRFP-TK和Puro~R-TK/Zeo~R-TK两套效率更高的双等位敲入系统,在APP位点得到了更为高效的双等位基因编辑效率,敲入效率分别为82%和70%。本研究开发了一套简洁高效,具有普遍适应性的单链退火(SSA)介导的基因组精确编辑系统,为基因功能研究、遗传疾病治疗和家畜生产性状改良提供了新的方案。基于此开发的三套高效的双等位编辑系统为双等位基因操作提供了新的思路,并为后续双等位基因精确编辑奠定了基础。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S813
【部分图文】：

序列,报告系统,工作原理,荧光基因

报告筛选一体化载体根据其修复原理可进一步分为，基于 NHEJ 修复原理、SSA修复原理或 HDR 修复原理的筛选报告一体化载体。本实验室受信号灯报告系统（TrafficLight Reporter, TLR）启发(Kuhar et al. 2014)，开发出了分别基于 NHEJ 和 SSA 修复原理的两套RPG(DsRed-PuroR-eGFP)报告筛选系统(Ren et al. 2015)。在两套 RPG 系统中，用自带启动子和终止序列的 DsRed 基因表达检测转染效率，利用被基因组靶位点序列打断的嘌呤霉素抗性基因和通过 T2A 剪切肽串联的绿色荧光蛋白来检测核酸酶效率和富集细胞。若嘌呤霉素抗性基因开放阅读框在核酸酶打靶之后发生修复，药物筛选基因与荧光基因则可得以顺利表达，进一步经过药物筛选或者流式分选得到打靶阳性细胞，即可用于计算核酸酶打靶效率。NHEJ-RPG 报告系统的阅读框修复是通过 NHEJ方式进行，因为阅读框有三种情况的移码修复，最终只有三分之一的修复情况能够实现抗性基因和荧光基因的顺利表达（图 1-2(a)）。SSA-RPG 报告系统在修复时，会通过 SSA 删掉断裂口两端其中一段重复序列，从而实现阅读框修复（图 1-2(b)）。其他研究中类似的筛选系统也同样是采用一个完整的荧光基因表达盒来显示转染效率，后单独或同时采用修复之后的荧光基因或药物抗性基因来筛选核酸酶工作阳性的细胞。

原理图,筛选工,工作原理图,载体

1.2.2 筛选基因的基因组整合表达筛选基因的基因组整合表达又可以分为预先整合筛选基因至基因组的报告细胞系和随供体整合两种形式。整合筛选基因的报告细胞系多用于研究双链断裂的修复机制、比较不同供体设计的效率高低或优化核酸酶等。在这类整合细胞系中，使用较为广泛的是采用信号灯报告系统（Traffic Light Reporter, TLR）(Certo et al. 2011)制作的整合细胞系(Davis et al.2011)。该细胞系可通过不同的修复方式产生不同的荧光信号，以研究双链断裂之后的HDR 和 NHEJ 两种修复机制各自的修复效率。TLR 报告系统可以通过慢病毒载体或者直接将报告系统载体线性化之后电转的方式进行构建，后经过荧光或者药物筛选得到(Kuhar et al. 2014)。例如：Chu 等人将 TLR 报告系统整合至基因组的 AAVS1 位点得到单等位整合的 AAVS1TLR/+和双等位整合的 AAVS1TLR/TLR两种报告细胞系(Chu et al.2015)，Lin 等将其用于研究融合 RecA 的 Cas9 蛋白的基因敲除效率(Lin et al. 2017)，之图 1-3 (a) 共打靶筛选工作原理图；(b) HDR-USR1 载体工作原理图Fig.1-3 (a) Function principle of co-targeting with selection; (b) Function principle of HDR-USR1 vector

示意图,编辑系统,基因组,工作原理

正后的诱导多能干细胞克隆(Xie et al. 2014)。Ye 等人s 或者 CRISPR/Cas9 制造双链断裂，将同时具有正负筛到基因组中，随后第二步通过转座酶将筛选表达盒移除 et al. 2014)。但是，由于 TTAA 位点在基因组中广泛机插入，因此在第二步负向筛选药物 FIAU (1-(2-deox-5-iodouracil)的压力作用下，会出现基因组中残留筛选性的假阳性单克隆，且试验结果证明，以上两个试验次整合概率都在 70%以上，给基因组留下了极大的安介导的重组删除办法系统之外，还存在通过两次 HDR 完成精确编辑的策略上面两种办法一样，在第一次打靶时敲入筛选标记基修复，将筛选标记基因删除(Xi et al. 2015)（图 1-4）。子甲基化而导致的筛选基因沉默，会降低第二步单。

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