猪Mx1蛋白抗PRRSV作用及其分子机制初探

发布时间：2020-09-26 21:29

　　 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是目前中国国内乃至全球范围养猪业中一种较为严重的病毒性传染性疾病,主要以引起母猪的繁殖障碍症状和仔猪的呼吸道疾病为特征。该疾病是由蓝耳病毒(PRRSV)引起,于1987年首次在北美被发现,随后便在世界范围内迅速而广泛传播,给全球的养猪业造成了极为巨大的的经济损失。然而目前该病并没有行之有效的科学的治疗手段,主要以预防为主。宿主细胞的抗PRRSV机制的研究能够为PRRS的防控及新型疫苗的研发提供新的思路和方法。本实验室成员已做的蛋白质组学iTRAQ技术研究结果表明,猪外周血单核树突状细胞(MoDCs)感染高致病性PRRSV后,在较长一段时间内,猪Mx1蛋白的表达显著上调。那么Mx1蛋白是否具有抗PRRSV的功能?其机制又是什么?为此,我主要进行了以下几个方面的研究:1、猪Mx1蛋白的抗PRRS病毒活性我构建了Mx1蛋白及其分段蛋白的质粒,通过TCID_(50)试验,我证明了猪Mx1蛋白可以大大降低PRRSV的滴度,表明Mx1蛋白具有显著的抑制PRRSV增殖的活性,其中,Mx1蛋白的G结构域发挥了主要的抗病毒作用。绝对荧光定量试验结果进一步证明,Mx1蛋白可以显著降低PRRSV gRNA水平,其中,G结构域发挥了主要作用。2、Mx1蛋白的G结构域与PRRSV的核衣壳蛋白N的C末端结构域互作为了探究Mx1蛋白与PRRSV的蛋白的相互关系,我构建了PRRSV所有结构蛋白与非结构蛋白的表达载体。通过Renilla Luciferase Assay(RLA)试验,成功筛选到了与Mx1互作的N蛋白,同时也筛选到与N蛋白互作的是Mx1蛋白的G结构域。随后我通过免疫共沉淀试验(Co-IP)辅助证明了这些结果。将N蛋白进一步分段后,Co-IP证明了G结构域与N蛋白的C末端结构域(NC)互作。3、Mx1蛋白的G结构域与N蛋白C末端结构域共定位于细胞质我将Mx1、Mx1突变体、G结构域的质粒分别与PRRSV N蛋白、N蛋白N端(NN)、N蛋白C端(NC)、N蛋白NLS突变体质粒共转染HEK-293T细胞,通过间接免疫荧光试验(IFA)证明,Mx1与N蛋白、G蛋白与NC蛋白可以共定位于细胞质,表明Mx1蛋白可能主要在细胞质中发挥抗病毒作用。综上所述,本研究首次初步揭示了猪Mx1蛋白抑制PRRSV增殖的分子机制,即猪Mx1蛋白在细胞质中通过G结构域与N蛋白的C端结构域互作,绑定到病毒衣壳蛋白N上,进而抑制了PRRSV的增殖,降低病毒滴度。本研究结果扩充了Mx1蛋白抗病毒分子机制的多样性,并为预防和控制PRRSV感染提供了新的思路和方法。
【学位单位】：齐鲁工业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S858.28
【部分图文】：

图1.2 PRRSV N蛋白的一级结构域[61]蛋白是PRRSV感染的细胞中含量最丰富的病毒蛋白，约占病毒粒子蛋白它在猪体内具有高度的免疫原性，而且被认为是具有多功能性[63]。PRRSV毒衣壳的唯一结构蛋白成分，通过共价和非共价相互作用与自身结合，为装提供了基础，共价键连接的N-N同二聚体通过位于23位的半胱氨酸残基质网(ER)和高尔基复合体的管腔内形成[64]。PRRSV的整个生命周期发生细胞质中，因此PRRSVN蛋白主要存在于细胞质和核周区域。由于具有核RRSVN蛋白也存在于感染细胞的细胞核和核仁中[65]。北美基因型PRRSVN位(10-KRKK)和41-47位(41-PGKKN/SKK)含有两个假定的NLS基序，这些似于Fpat4-和Fpat7-NLS。先前使用PRRSV SDSU-23983分离物的研究工作-NLS对N的核定位是充分必要的。PRRSVN蛋白的功能核定位信号(NLS)已位的碱性氨基酸(PGKKNKK)中被识别，并已被证明与核转运蛋白import-a[66]。因此，研究人员认为N蛋白可以经由核定位信号依赖性的输入蛋白α和运途径实现入核。由于PRRSV的装配和成熟发生在ER和高尔基区，因此

图 1.3 Mx 蛋白的一级结构域[78]1.3.2 Mx 蛋白的抗病毒功能Mx 基因随后在其他脊椎动物中被鉴定出来，通常有一到三个亚型。这些 Mx 蛋白中的许多，包括人类同源蛋白 MxA，对多种 RNA 病毒和一些 DNA 病毒具有抗病毒活性[79]。许多 Mx 蛋白，包括人类同源蛋白 MxA，对诸多 RNA 病毒和一些 DNA 病毒具有显著的抗病毒活性[80]。这种活性据推测随蛋白质的亚细胞定位的不同而改变。细胞核形式(如小鼠 Mx1)可防止病毒在细胞核内复制，如流感病毒和托高土病毒[81]，而细胞质形式(如小鼠 Mx2)可抑制水泡性口炎病毒(VSV)和其他一些病毒在细胞质内复制[82]。人类的 MxA 蛋白定位在细胞质中，但无论在何种情况下都具有广泛的抗病毒谱病毒的亚细胞复制位点[83]。1.3.3 猪 Mx1 蛋白的抗病毒功能目前总共有两种 Mx 基因已在猪中被报道，并被分别命名为 Mx1 和 Mx2[84]。全长的猪 Mx1(poMx1)基因(1,992 bp)首次从德国长白猪 Landrace 品种中分离出来，并定[85]

第 2 章 猪 Mx1 蛋白抗 PRRSV 活性的功能研究.2 试验方法.2.1 Mx1 及分段基因真核表达质粒的构建与鉴定(1) 引物设计与合成根据猪 Mx1 基因序列（GenBank 登录号：AB164037）将 Mx1 基因分为如下部分：SE1，1-201 bp；G domain，202-1023 bp；BSE2，1024-1101 bp；MD+Loop4，1102-728 bp；GED，1729-1983 bp。对 Mx1 基因结构划分如图 2.1 所示。分别将 Mx1 全长，BSE1+G domain（G），G domain+BSE2+MD（GMD），SE2+MD+Loop4（MDL4）以及 GED 片段进行了扩增，利用 Primer premier 5 软件各计一对含 Not I，Hind III 酶切位点的特异引物，上游引物添加 Flag 标签序列，引物列见表 2.1。

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本文编号：2827511