PRRSV具有跨膜特性的非结构蛋白参与病毒复制转录复合体形成机理的研究
发布时间：2020-09-28 16:58
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是严重危胁到全球养猪业的传染性疾病,其病原体是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。PRRSV编码的非结构蛋白nsp2、nsp3和nsp5是跨膜蛋白。为了探究这几个跨膜蛋白在病毒复制转录复合体(RTC)形成中的作用,本研究筛选并鉴定了与这三个跨膜蛋白存在相互作用的非结构蛋白。首先采用酵母双杂交技术(Y2H),筛选出与nsp2、nsp3和nsp5有相互作用的蛋白,然后用双分子荧光互补(BiFC)技术验证了这些存在相互作用的蛋白,以去除假阳性结果。通过Y2H和BiFC,检测到nsp9、nsp12和跨膜蛋白nsp3、nsp5与多个非结构蛋白有相互作用,表明这些非结构蛋白可能充当RTC形成的核心组分。最后使用Pull-down技术进一步验证其中的部分蛋白间的相互作用。包含预测的跨膜结构域的疏水性非结构蛋白nsp2、nsp3和nsp5被认为涉及膜修饰和双层膜囊泡(DMV)的形成,这是由动脉炎病毒感染诱导的典型结构。在PRRSV的3种跨膜的非结构蛋白之间,我们发现nsp2与nsp3、nsp5与nsp3存在相互作用,并且nsp3自身也可以相互作用,因此推测这三种PRRSV跨膜蛋白可能在病毒复制过程中形成膜结合的nsp2-nsp3(×n)-nsp5复合体,即以nsp3为中心,nsp2和nsp5为侧翼形成一个锚定在DMV膜上的一个支架,为复制转录复合体的形成起到招募非结构蛋白,并给以nsp9和nsp12为中心的RTC结构提供支撑,从而参与病毒的复制转录过程。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：
其在病毒感染中的功能仍然未知。通过内部切割位点，nsp7 可以进 步切割成 nsp7α 和 nsp7β，然而，通过蛋白质印迹和放射免疫沉淀法仅在 PRRSV 感染的细胞中检测到切割的 nsp7α。虽然基于结构的反向遗传学研究已经证明 nsp7 在动脉病毒 RNA合成中起重要作用（Ioannis Manolaridis et al. 2011; Zhang et al. 2013），但它的特定功能还不清楚。作为病毒 RNA 合成的关键酶，nsp9 被认为是病毒复制和转录复合物（RTC）的核心成分，具有很高的保守性（Li,Yetal.2014）。所以，在病毒复制过程中，nsp9 具有很重要的作用（Dong,Jetal.2014）。RdRp 结构域位于 nsp9 的 C 端部分，蛋白质的 N端部分被鉴定为与病毒 RdRp 相关的核苷酸转移酶结构域（LongLiuetal.2016）,在所有的正链 RNA 病毒中 RdRp 是病毒复制转录所必须的（O'ReillyEK1998）。nsp10 行使核酸解旋酶功能（YingFangandEricJ.Snijder2010），nsp11 具有对内源性核糖核酸酶活性的抑制作用（Terje Dokland 2010），这种抑制作用可以抑制 NLRP3 炎症小体介导的 IL-1β 诱导（Wang Chao et al. 2015; Bautista et al.2002; Seybert et al. 2005），有研究表明，nsp11 也是以二聚体的形式存在（Shi et al. 2016）。nsp12 则可能与细胞内的核酸结合蛋白存在相互作用（Dong et al. 2016）。
第二章 酵母双杂技术筛选与 PRRSV 跨膜 nsp 的互作蛋白9表 2-1 引物名称与序列Table 2-1 Prime name and sequence引物名称（Prime name） 引物序列（Prime sequence）NdeINSP2-F GGAATTCCATATGGCTGGAAAGAGAGCAAGGBamHINSP2-R CTAAGGATCCGGGTAAGTCAGCACCACCNdeINSP3OD1-F GGAATTCCATATGTATGTAACTGCAGTGGGGTCBamHINSP3OD1-R CATAGGATCCCACAAGTGCTGTCAAGGGCNdeINSP3OD2-F GGAATTCCATATGCGTTATACTAATGTTGTTGGTCBamHINSP3OD2-R GAATGGATCCCTCAAGAAGGGACCCAAGNdeINSP5OD1-F GGAATTCCATATGGGACATGCCTGGACGBamHINSP5OD1-R CACGGGATCCTCTGTTCCTGTTAAGAGNdeINSP5OD2-F GGAATTCCATATGGCAACTCAAGGGCACCCGBamHINSP5OD2-R ATTAGGATCCCCGAGGCAGGAAGGCATAG
图 2-2 感受态的制备与转化流程图Fig.2-2 Process for the preparation and transformation of bacterial competent cells2.2.3 阳性 隆的鉴定从平板上随机挑取 3 个单克隆，进行菌落 PCR，用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，将阳性结果的单菌落，接种到含有相应抗生素的 LB 液体中，过夜培养，然后提取质粒。重组质粒使用限制性内切酶 BamHⅠ和 NdeⅠ进行双酶切，双酶切反应总体积为 20μL，酶切体系参照表 2-3。酶切结果用 1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳检测后的重组质粒，送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。2.2.4 制备与转化酵母感受态 胞酵母感受态的制备严格按照 Clontech 公司的酵母转化系统 2 操作说明书进行，在此不再赘述。取 1.5mL 的离心管依次加入表 2-5 中的成分，混合均匀后，于 30℃、150rpm 培养至少 30min，避光条件下加入 20μL 的 DMSO，混合均匀后，于 42℃下，水浴 15min，每隔 5min 轻摇 次，6000rpm 离心 15s，弃上清，使用 200μL0.9%的生理盐水重悬后，涂布于二缺培养基上。酵母感受态的制备及转化的主要实验流程，如图 2-3 所示。
本文编号：2829029
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：
其在病毒感染中的功能仍然未知。通过内部切割位点，nsp7 可以进 步切割成 nsp7α 和 nsp7β，然而，通过蛋白质印迹和放射免疫沉淀法仅在 PRRSV 感染的细胞中检测到切割的 nsp7α。虽然基于结构的反向遗传学研究已经证明 nsp7 在动脉病毒 RNA合成中起重要作用（Ioannis Manolaridis et al. 2011; Zhang et al. 2013），但它的特定功能还不清楚。作为病毒 RNA 合成的关键酶，nsp9 被认为是病毒复制和转录复合物（RTC）的核心成分，具有很高的保守性（Li,Yetal.2014）。所以，在病毒复制过程中，nsp9 具有很重要的作用（Dong,Jetal.2014）。RdRp 结构域位于 nsp9 的 C 端部分，蛋白质的 N端部分被鉴定为与病毒 RdRp 相关的核苷酸转移酶结构域（LongLiuetal.2016）,在所有的正链 RNA 病毒中 RdRp 是病毒复制转录所必须的（O'ReillyEK1998）。nsp10 行使核酸解旋酶功能（YingFangandEricJ.Snijder2010），nsp11 具有对内源性核糖核酸酶活性的抑制作用（Terje Dokland 2010），这种抑制作用可以抑制 NLRP3 炎症小体介导的 IL-1β 诱导（Wang Chao et al. 2015; Bautista et al.2002; Seybert et al. 2005），有研究表明，nsp11 也是以二聚体的形式存在（Shi et al. 2016）。nsp12 则可能与细胞内的核酸结合蛋白存在相互作用（Dong et al. 2016）。
第二章 酵母双杂技术筛选与 PRRSV 跨膜 nsp 的互作蛋白9表 2-1 引物名称与序列Table 2-1 Prime name and sequence引物名称（Prime name） 引物序列（Prime sequence）NdeINSP2-F GGAATTCCATATGGCTGGAAAGAGAGCAAGGBamHINSP2-R CTAAGGATCCGGGTAAGTCAGCACCACCNdeINSP3OD1-F GGAATTCCATATGTATGTAACTGCAGTGGGGTCBamHINSP3OD1-R CATAGGATCCCACAAGTGCTGTCAAGGGCNdeINSP3OD2-F GGAATTCCATATGCGTTATACTAATGTTGTTGGTCBamHINSP3OD2-R GAATGGATCCCTCAAGAAGGGACCCAAGNdeINSP5OD1-F GGAATTCCATATGGGACATGCCTGGACGBamHINSP5OD1-R CACGGGATCCTCTGTTCCTGTTAAGAGNdeINSP5OD2-F GGAATTCCATATGGCAACTCAAGGGCACCCGBamHINSP5OD2-R ATTAGGATCCCCGAGGCAGGAAGGCATAG
图 2-2 感受态的制备与转化流程图Fig.2-2 Process for the preparation and transformation of bacterial competent cells2.2.3 阳性 隆的鉴定从平板上随机挑取 3 个单克隆，进行菌落 PCR，用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，将阳性结果的单菌落，接种到含有相应抗生素的 LB 液体中，过夜培养，然后提取质粒。重组质粒使用限制性内切酶 BamHⅠ和 NdeⅠ进行双酶切，双酶切反应总体积为 20μL，酶切体系参照表 2-3。酶切结果用 1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳检测后的重组质粒，送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。2.2.4 制备与转化酵母感受态 胞酵母感受态的制备严格按照 Clontech 公司的酵母转化系统 2 操作说明书进行，在此不再赘述。取 1.5mL 的离心管依次加入表 2-5 中的成分，混合均匀后，于 30℃、150rpm 培养至少 30min，避光条件下加入 20μL 的 DMSO，混合均匀后，于 42℃下，水浴 15min，每隔 5min 轻摇 次，6000rpm 离心 15s，弃上清，使用 200μL0.9%的生理盐水重悬后，涂布于二缺培养基上。酵母感受态的制备及转化的主要实验流程，如图 2-3 所示。
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 吴加强,姜平;猪繁殖与呼吸综合征[J];畜牧与兽医;1999年S1期
相关硕士学位论文 前2条
1 许傲天;高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp4的表达与功能研究[D];中国农业科学院;2010年
2 陈静;重庆市部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的遗传变异分析[D];西南大学;2009年
本文编号：2829029
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/2829029.html
