基于卵巢全转录组学和代谢组学筛选影响猪产仔数性状的候选基因、非编码RNA及miR-183-circTCP1轴的功能验证

发布时间：2020-09-28 12:46

　　产仔数是猪繁殖性状一个重要的经济性状,是反应猪场生产水平和经济效益的重要指标。卵巢是母猪重要的生殖器官,在每个发情周期都经历一系列的生物学过程,卵巢中包含编码基因和非编码基因的复杂转录网络紧密调控着母猪的产仔。但这些影响母猪产仔数的分子调控机理仍不明晰。本课题选择猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)是抗原阴性的高产仔数(LLS,larger litter size)和低产仔数(SLS,smaller litter size)大白长白二元杂交母猪为研究对象,利用卵巢全转录组测序(RNA Sequencing,RNA-seq)以及卵巢代谢组学分析策略,筛选与母猪高产性状相关的关键候选基因、microRNA、circRNA、lncRNA、代谢物、GO条目和KEGG通路,建立初步的影响母猪产仔数分子调控网络体系。然后,通过用RT-qPCR、EdU染色实验、CCK-8实验、Western Blot、流式细胞检测和双荧光素酶检测等方法对该分子调控网络体系中重要节点miR-183-circTCP1轴进行体外功能验证,深入研究影响母猪产仔数的分子调控机制。主要研究结果如下:1、基于卵巢全转录组学筛选影响母猪产仔数性状关键候选基因本研究对LLS组和SLS组大白长白二元杂母猪卵巢进行去核糖体RNA的高通量测序。每个样本得到约1亿clean reads,与猪参考基因组匹配率最高为96.3%,最低为94.1%。在LLS组较SLS组卵巢组织中鉴定出2708个差异表达基因,其中上调的差异表达基因有1110个,下调的差异表达基因有1598个。通过GO和KEGG分析得到15个STAR、HSD17B2、HSD17B12、BMP6、BMP4、INHBA、BMP2、GDF7、TGFBR1、TGFB3、BMP7、AKR1C1、CYP21A2、GDF5和HSD17B8可能影响猪产仔数的候选基因,富集在Hippo信号通路、TGF-beta信号通路、类固醇激素合成和卵巢甾类激素合成4条对产仔数有影响的通路。其中在LLS组较SLS组的卵巢组织中,上调的差异表达基因有STAR、HSD17B2、HSD17B12、INHBA、TGFBR1、AKR1C1,下调的差异表达基因有BMP6、BMP4、BMP2、BMP7、GDF5、GDF7、TGFB3、CYP21A2、HSD17B8。2、基于卵巢全转录组学筛选影响猪产仔数的非编码RNA利用RNA-seq,在LLS组较SLS组的卵巢组织中筛选出差异表达的miRNA、lncRNA和circRNA分别为33、302和548个,并挑选了在LLS组和SLS组间表达量差异显著,且与卵巢发育、卵巢类固醇激素合成相关非编码RNA进行了RT-qPCR的验证。构建了lncRNA-miRNA-mRNA和circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络结构,找到影响猪产仔数的关键候选miRNA 2个(miR-183、miR-1343)、关键候选lncRNA 4个(LOC110259814、LOCLOC106504714、LOC106505099和LOC110257180)、关键候选circRNA7个(circ-TCP1、circ-PAN3、circ-DDX19B、circ-LOC106505137、circ-ANKRD12、circ-SNX25和circ-SLA-5)。3、基于卵巢代谢组学筛选影响猪产仔数性状的关键代谢物及其候选基因主要利用代谢组学对LLS和SLS两组猪的卵巢组进行了代谢产物的分析,最终得到55个差异代谢产物,并主要富集在18条差异的通路上。在这18条差异通路上,多条通路共有的关键代谢物有:苯胺、组胺和1-哌啶,影响这三个代谢物的关键候选基因主要有6个(ANXA8、LOC100524773、LOC110258110、DDO、,SMIM1和AZGP1)。其中组胺富集在FcεRI信号通路上。这些重要的节点可能是影响猪产仔性能的潜在因素。4、miR-183在高产性母猪卵巢中的功能和miR-183-circTCP1轴的鉴定(1)miR-183能促进猪卵巢颗粒细胞(GCs)的增殖,对GCs凋亡没有显著的影响。(2)miR-183在细胞S期,抑制了颗粒细胞雌二醇(E2)的合成而促进了孕酮(P4)的合成,3β-HSD是P4合成过程中的关键功能基因,Cyp19a1是E2合成过程中的关键功能基因。(3)miR-183在LLS组水平显著上调,较SLS组产生优势卵泡颗粒细胞,促进卵泡的发育,从而提高猪产仔数。(4)circ-TCP1可能作为ceRNA竞争性吸附miR-183,在母猪高产性相关的生物过程中发挥关键调控作用。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S828
【部分图文】：

核磁共振,代谢组学,相对敏感性,平台

学（检测样品中代谢分子的相对含量，尽可能鉴定所有代谢物）、广泛靶向代代谢物进行准确地定量和定性）等。目前，代谢组学分析主要分为以下几个样品的准备和制备；（2）数据的采集和处理；（3）代谢途径的推测和解析等析技术平台是决定代谢组学的成败的关键。随着技术平台的发展，代谢组学统的核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR），高通量、高精确度的ss spectrometer，MS）以及现在运用比较多的气相色谱-质谱联用matography-mass spectrometry，GC-MS）和液相色谱-质谱联用（high perforid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）技术。Goldansaz 等详细的同技术平台的灵敏度和检测覆盖范围（如图 3-2）(Goldansaz et al., 2017)不敏感，仅限于测量毫摩尔（mM）到微摩尔（μM）浓度范围内的代谢物。而可以检测到纳摩尔（nM）至皮摩尔（pM）浓度之间的代谢物，从而可以检测代谢产物。Dharuri H 等研究表明，MS 可以检测到包括糖醇、脂肪酸、氨基括大量的次级代谢分子在内的数百种化学性质不同的化合物(Dharuri et)。由于 GC-MS 只有具有挥发性的物质方可使用，因此在样品预处理显得更为繁用范围也受到一定的限制。因此 LC-MC 技术更广泛的应用于各类研究中。

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图 2-1 凝胶电泳检测猪卵巢总 RNA 质量Fig.2-1Detection of total RNA quality in porcine ovaries by gel electrophoresis2.2.2 测序数据的质量控制RNA 测序后，使用 Fast-QC（网址：http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk）对原始数据进行整体的评估，包括碱基质量分布、GC 含量分布等。如图 2-2 所示，质量分数值大于 30 表示测序碱基准确度大于 99.9%。从图 2-2 中可以看出，所测样品中高产仔数猪分别为 92.56%、92.40%和 82.21%，低产仔数猪为 90.21%、92.46%和 78.43%。因此，本次测序的碱基质量较好，可以用于后续研究。

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图 2-2 样品 SLS1/2/3 和 LLS1/2/3 的碱基测序准确性Fig.2-2 Base sequencing accuracy of samples SLS1/2/3 and LLS1/2/3接下来我们检测了样品中的 GC 含量的分布情况，如图 2-3 所示，高产猪和低产猪中实际线条分布于正态分布接近，说明测序结果较好，可用于后续的生物信息学分析。

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