奶牛缺陷精子鉴别与去除技术开发及其在性控冷冻精液生产应用研究

发布时间：2020-09-28 07:30

　　 奶牛性控冷冻精液人工授精的性控繁育技术可以快速增加良种奶牛数量,提升奶牛养殖经济效益,是目前奶牛养殖产业化推广应用最成功、最有效的繁育生物技术手段。奶牛缺陷精子包括形态畸形与顶体破损、DNA缺陷、死精子三种类型。奶牛精液中的缺陷精子直接影响奶牛种公牛遗传资源利用率、性控冷冻精液生产效率及其人工受精的受胎率。本研究旨在通过特异性蛋白鉴别三种奶牛精液中的缺陷精子,然后与免疫磁珠结合在X"Y精子性控分离前去除缺陷精子,提高奶牛性控冷冻精液生产效率及产品中的正常精子比例,促进该产品的产业化应用效果,同时为人工辅助生殖等相关方面的研究和应用提供一定的实验依据。本研究共分两部分:第一部分为畸形与顶体破损、DNA缺陷奶牛精子的鉴别及结合免疫磁珠方法的奶牛精液中缺陷精子去除技术研究。首先分析确认奶牛精子泛素化水平同精子畸形及精子DNA缺陷的相关性。实验结果显示,通过western blotting和单通道流式细胞法检测均证明奶牛精子泛素化水平同精子畸形率具有显著相关性(p0.05);进一步通过双通道流式细胞法检测结果表明,奶牛精子泛素化水平同精子DNA缺陷水平具有显著相关性(p0.05)。在此基础上,选择抗泛素化蛋白作为特异抗体,设计了结合免疫磁珠抗泛素化蛋白去除奶牛精液中的畸形与顶体破损、DNA缺陷精子的技术流程。实验结果表明该技术流程可以有效去除奶牛精子中的畸形和顶体破损精子(p0.05)。结论:利用特异性抗泛素化蛋白与免疫磁珠结合,可以在X"Y精子性控分离前明显去除奶牛精液中的畸形和顶体破损缺陷精子,提高奶牛性控冷冻精液产品质量。第二部分为奶牛死精子与膜联蛋白V(Annexin V)的特异性结合确认及免疫磁珠方法去除奶牛死精子的应用技术研究。实验研究结果表明,Annexin V可以与奶牛死精子进行特异性结合。据此选择Annexin V作为奶牛死精子的特异标记,然后设计利用免疫磁珠结合Annexin V去除奶牛精液中死精子的技术流程。实验结果显示分选后精子的活力、膜完整性、线粒体活性和X"Y分离死精率均有不同幅度的改善,说明该技术流程设计可以有效去除部分死精子,但是对于分离后的X或Y精子制备的性控冷冻精液各项指标均没有明显影响(p0.05)。结论:利用膜联蛋白V(Annexin V)的特异性结合免疫磁珠方法可以有效去除奶牛精液中的死精子,显著降低性控分离时的奶牛精子死精率(p0.05),有效提高奶牛性控冷冻精液生产效率、降低了生产成本,推动了该产品的产业化应用。
【学位单位】：内蒙古大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S823
【部分图文】：

内蒙古大学博士学位论文2.12 精子膜完整性检测加80μL现配的6-CFDA/PI染色液至20μL 精液样品中，然后37℃水浴锅避光温育10min。孵育后 800g 离心 5min。然后取 30μL 的 0.01M PBS 重新悬浮，用移液器吸取取 15μL 精子混合液到干净载玻片上，盖玻片压片，荧光显微镜下观察，根据精子所染荧光颜色差别判断精子膜是否完整，每个样品计数 200 个以上精子。被 6-CFDA 完全染成绿色的膜完整精子（FITC 滤光片下观察）；被 PI 染成红色的膜破损精子（Rcodamine 滤光片下观察）；精子膜完整性 =总精子数膜完整精子数×100%

内蒙古大学博士学位论文2.13 精子线粒体活性检测加 80μL 现配的 MITO 染色液至 20μL 精液样品中，37℃水浴锅避光温育 20min，然后在以上精液混合液中加入 500μL PBS 缓冲液，500g 离心 5min 后弃掉上清。然后取 30μL 0.01MPBS 重新悬浮，吸取 10μL 混合液到干净载玻片上，盖玻片压片于荧光显微镜下观察，根据精子尾部中段线粒体区域是否有红荧光辨别精子是否具有线粒体活性，每样本计数 200 个以上精子。精子线粒体活性 =总精子数具有线粒体活性精子数×100%

内蒙古大学博士学位论文然后用加一定量 PBS 溶液重悬，调整精子浓度至 1～2×106/mL。移液枪吸取 40μL 精子悬液涂片，空气中自然干燥，用纯甲醇固定 10 min，接着加入 50μL FITC-PNA 染液，37℃、阴暗潮湿环境下孵育至少 30 min 后用 PBS 溶液小心冲洗载玻片，待自然干燥后，加一定量增光剂并用无色指甲油封片。在 1000×荧光显微镜下镜检，通过荧光观察顶体形态以判断精子顶体是否完整。每次检测时，每个样本至少计数 200 个精子。精子顶体完整率 =总精子数顶体完整精子数×100%

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本文编号：2828511