猪HEV衣壳蛋白单克隆抗体结合抗原表位的鉴定及其抗病毒感染机制研究

发布时间：2020-09-27 19:06

　　戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是感染人类后引起肝脏疾病的一种人畜共患性病毒,在自然界中具有广泛的宿主来源。猪被认为是HEV的重要贮存宿主,主要包括基因3和4型,与人HEV的同源性可达80%-90%。猪HEV可以通过食源性或水源性途径传播给人类,因此阻断猪HEV传播具有重要的公共卫生意义。HEV ORF2编码病毒衣壳蛋白,不仅保证病毒基因组的完整性,还参与病毒多项重要生理活动;HEV ORF2上具有主要的抗原表位区,是关键的疫苗研发靶区。实验室前期原核表达的猪HEV ORF2截短蛋白(sORF2-C,aa 393-660),经验证具有良好的抗原性和免疫原性。将其免疫小鼠后经杂交瘤制备获得抗猪HEV的三株单抗2C7,1E4和2G9。本研究通过原核表达sORF2-C截短蛋白、合成短肽等方法验证三株单抗在ORF2的结合位点,利用模拟病毒的sp239蛋白吸附HepG 2细胞,以及作为HEV感染动物模型的兔子设计试验,验证单抗在体外和体内的抗病毒中和作用,以及单抗识别表位的免疫保护作用。本研究主要内容和结果如下:1.抗猪HEV衣壳蛋白单抗识别抗原表位的鉴定原核表达sORF2-C截短蛋白后,用Western blotting与间接ELISA方法与单抗反应,找到其结合区域(4-7个氨基酸),进一步合成短肽确定位于基因4型HEV衣壳蛋白上三株单抗2C7、2G9和1E4识别的表位分别为~(407)EPTV~(410),~(458)PSRPF~(462)和~(625)DFCP~(628)。1B5是经实验室前期验证在猪、人、禽HEV上识别共有表位~(410)VLYTS~(411)的单抗。空间结构预测验证了2C7、2G9和1B5识别的表位部分位于病毒表面,预示其可能具有抗病毒中和活性。同时,病毒捕获试验结果显示单抗2G9,1B5和2C7分别在400,400和200 ng/孔的包被浓度下可以捕获到天然病毒;而1E4和小鼠阴性IgG均未捕获到病毒。此外,序列分析比对发现2C7、2G9和1B5识别的三个表位在人、猪、兔及等其他动物源HEV中高度保守。2.抗猪HEV衣壳蛋白单抗抗病毒中和活性的鉴定有研究显示原核表达基因1型HEV p239(368-606)蛋白可模拟病毒吸附HepG 2细胞。因此,本研究通过原核表达基因4型猪HEV ORF2对应区域的截短蛋白,命名为sp239(aa 368-606),证明其在PB7.5溶液中组装形成多聚体。经IFA、Western blotting、FCM和RT-PCR验证,sp239可模拟病毒吸附并进入HepG 2细胞,此外,2G9、2C7和1B5均可在体外部分阻断sp239或病毒(利用低效病毒感染细胞系HepG 2)吸附HepG 2细胞;同时,本试验利用兔子作为HEV感染动物模型,将2G9、2C7和1B5(1E4与阳性血清作为阴、阳型对照组,同时设置正常组和仅攻毒组)与猪HEV粪便悬液孵育混合后接种兔子,检测其粪便排毒、病毒血症和抗体水平,发现单抗或阳性血清均能部分阻断病毒感染兔子,或相较于攻毒组,出现粪便排毒延迟现象。以上结果说明,2G9、2C7和1B5具有中和猪HEV的活性,其识别的抗原表位可作为潜在的疫苗设计靶点。3.基因4型猪HEV中和表位免疫保护效果研究基因4型猪HEV ORF2衣壳蛋白的三株单抗2G9、2C7和1B5经体内验证具有中和病毒活性,提示其识别的表位可能产生抗HEV中和抗体。因此,本试验根据三株中和表位设计合成短肽:Pep EPTV(2G9)、Pep VKLYTS(1B5)、Pep PSRPF(2C7)、Pep EPTVKLYTS(2G9-1B5)和Pep EPTVKLYTSPSRPF(2G9-1B5-2C7);将以上短肽分别连接KLH及BSA用于免疫和检测。合成后将短肽皮下免疫兔子,待抗体水平达到峰值并稳定后耳缘静脉攻毒猪HEV,攻毒后每周检测粪便排毒、病毒血症和抗体水平等指标发现:免疫短肽Pep EPTVKLYTSPSRPF或sp239后,兔子未出现HEV所引起的致病性反应,说明上述短肽对兔子感染基因4型猪HEV具有良好的保护效果;此外,免疫短肽Pep VKLYTS,Pep PSRPF,Pep EPTV和串联表位短肽Pep EPTVKLYTS对兔子产生部分保护作用。综上所述,本研究中抗基因4型猪HEV的三株单抗2G9,1B5和2C7经体内、外试验均验证其具有抗病毒中和活性;鉴定其识别HEV ORF2上的表位分别为~(407)EPTV~(410),~(410)VKLYTS~(411)和~(458)PSRPF~(462),据此合成短肽并设计动物试验验证其可在兔子体内产生保护性抗体,保护兔子免受基因4型猪HEV的感染。因此,以上试验结果为HEV疫苗设计提供靶点和理论依据,对于HEV的防控有积极意义。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.651
【部分图文】：

基因组结构

图 1-1 HEV 基因组结构（引自(Kamar et al. 2017)）Fig.1-1 HEV genome structure (cited from (Kamar et al. 2017))ORF1 编码一个由 1700 个氨基酸组成的非结构蛋白，包括病毒 RNA 复制所需要的酶：甲基转移酶（MeT），番木瓜蛋白样蛋白酶（PCP），解旋酶（Hel）以及 RNA 依赖性 RNA 聚合酶（RdRp）(Koonin et al. 1992)。聚脯氨酸区域（PPR）是一段基因高变区，复制或插入的部分 ORF1 片段在此区域中被鉴定出(Johne et al. 2014; Lhomme et al2014; Shukla et al. 2011)。HEV 慢性感染免疫功能低下的患者后，PPR 区往往出现高度变异(Lhomme et al. 2014)。基因 1 型 HEV 的 ORF1 包括一个额外的开放性阅读框，即ORF4。内质网应激并与真核细胞伸长因子 1α1 互作后，激活病毒的聚合酶活性，由此产生了 ORF4 蛋白(Nair et al. 2016)。ORF2是660个氨基酸组成的病毒衣壳蛋白，因此也常用作HEV的检测抗原。ORF2具有 3 个糖基化位点（Asn132，Asn310 和 Asn562）以及一个引导其进入内质网的氨基酸末端信号肽(Zafrullah et al. 1999)。衣壳蛋白分为 3 个 domain，即 Shell，Middle 和Protruding domain。其中，Protruding domain 是中和抗体的主要靶区，包括预测受体结

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图 1-2 戊型肝炎病毒（HEV）复制，组装和释放的示意图。（引自(Ju et al. 2019)）Fig.1-2 Schematic representation of hepatitis E virus (HEV) replication, assembly, and release. (citedfrom (Ju et al. 2019) )衣壳蛋白内装配病毒基因组被认为是由 ORF2 与 HEV 基因组 RNA 的互作并进调节后形成具有感染性的病毒颗粒的过程。ORF2进化出一种可以区分病毒基因组RN和宿主 RNA 的机制，以确保病毒准确无误地组装。ORF2 N’末端的信号肽可能通过HEV 基因组 5’末端的 76-nt（装备信号）区域互作，参与病毒组装过程中 RNA 基因的装备(Surjit et al. 2004; Tam et al. 1991)。但这种互作需要更详细的遗传分析来确认研究者推测HEV转录编码ORF2和ORF3的RNA亚基因组转录产物(Graff et al. 2006)因此，RNA 衣壳装配信号可能位于基因组的 5’末端，保证只有基因组全长的 RNA 能够装配在衣壳蛋白上。ORF2 寡聚化后形成二十面体衣壳，再装配基因组 RNA，OR在接触到衣壳化信号后继续寡聚化（图 1-2）。然而，RNA 介导的 ORF2 寡聚化以ORF2 负责寡聚化区域仍然未知。由于缺乏可用的高效培养细胞系，HEV 病毒粒子的组装机制仍然不清楚。关于

戊型肝炎病毒,生命周期

第一章文献综述EV 的病理生理学V 是一种非致病性病毒。急性感染 HEV 的结果是由宿主免疫应答的vanel et al. 2016; Suneetha et al. 2012)。HEV 的发病包括三个不同阶段：性感染期（从无症状演变为急性肝衰竭）和逐渐恢复的康复期。虽然有自限性，但慢性感染会发生在免疫功能低下的个体。在免疫功能低时，细胞介导的免疫应答被抑制，导致猪体产生慢性肝炎并长期排毒

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