GPR120对肥胖母猪胎盘发育的影响及其参与脂肪分化调控的机制

发布时间：2020-09-28 17:55

　　脂肪组织既是一个储能器官,也是一个重要的内分泌器官。脂肪组织的形成主要包括脂肪生成和脂肪蓄积两个事件。脂肪过厚不仅影响猪的生长速度、饲料效率和胴体品质,而且影响猪的繁殖性能并对全身性代谢产生影响。因此,从脂肪细胞生成和脂质代谢两个角度去阐明脂肪组织形成的机制,并探索体脂沉积的营养调控技术是目前研究的热点问题之一。本实验室前期研究发现,妊娠期母猪过肥时,显著增加了弱仔的比率。因此,解析妊娠期母猪过肥时弱仔发生的具体机制及妊娠期母体的脂肪发育与代谢的调节机制具有重要意义。过去二十多年的研究发现,脂肪细胞生成受到了高度复杂且精密的转录级联网络调控,核受体过氧化物酶增殖子激活受体γ(Peroxisome Proliferator Activated Receptorγ,PPARγ)是调控成脂分化的关键转录因子,能响应长链多不饱和脂肪酸,发挥促进成脂分化、胎盘形成和血管生成等重要的生物学功能。近年来的研究发现,细胞膜上的G蛋白偶联受体120(G protein coupled receptor 120,GPR120)也具有响应LCPUFA促进成脂分化的作用,但其调控机制不明。那么,细胞膜上GPR120被激活后,是通过什么信号传导途径传入细胞核中的?这些信号是怎样激活PPARγ从而促进成脂分化的?另外,妊娠期母体肥胖条件下,GPR120和PPARγ的表达是否受到影响,并引发胎盘功能异常,这些重要的问题都值得深入研究。因此,本研究以妊娠期不同背膘母猪为研究对象,探讨妊娠期母体过肥影响低初生重(Low Birth Weight,LBW)仔猪(下称弱仔)发生的机制,揭示GPR120等关键基因的正常表达对于胎盘功能的影响;并阐明GPR120通过PPARγ调控脂肪分化的机制。第一部分母猪妊娠肥胖对胎盘发育的影响及其机制研究1、选择1090头胎次为1-4胎的长大二元杂母猪在妊娠109天度量了P2背膘厚。按照背膘厚分为3组,即≤17mm(第1组),18-20mm(第2组),≥21mm(第3组),统计并分析了三组间弱仔发生率的情况,结果发现:三组背膘不同的母猪中,第3组中仔猪初生重≤0.9kg和≤1.0kg的发生率分别是7.1%和11.51%,显著高于其他两组(P0.01)。2、采集了21头母猪的150份胎盘组织样品(三组分别是8头,56份胎盘;5头,38份胎盘;8头,56份胎盘),保证胎盘与胎儿一一对应。通过分析胎盘组织中甘油三酯发现,第3组显著高于第二组(P0.05),相比于第1组有升高的趋势。胎盘的血管发育和血管发育关键基因PPARγ和血管内皮生长因子A(VEGFA)的表达并没有显著差异。值得注意的是:我们进一步分析发现,三组背膘下,LBW仔猪的胎盘及血管发育的关键基因PPARγ和VEGFA表达均显著低于其他2组;相对于其他两组,胎盘组织中PPARγ和VEGFA蛋白表达水平也显著下调。通过建立了高效液相色谱-质谱联用方法检测胎盘组织的6-甲基腺嘌呤(m6A)水平,结果发现:LBW仔猪胎盘中m6A水平显著高于其他各组(P0.01);m6A去甲基化酶FTO的蛋白水平显著低于其他各组(P0.01),而m6A甲基转移酶METTL3表达没有发生相应的变化;对应的FTO和METTL3的基因表达却没有受到影响。通过建立了Me RIP-QPCR方法,结果表明:第3组LBW仔猪胎盘中PPARγ和VEGFA mRNA上m6A甲基化水平显著升高(P0.01)。这些结果表明:在不同母体背膘下,背膘过厚的母猪LBW仔猪的形成,可能增加PPARγ和VEGFA mRNA上高m6A修饰水平,从而抑制其基因和蛋白的表达,引发弱仔胎盘血管发育障碍。这暗示肥胖母体和正常母体下,LBW仔猪发生原因可能并不相同。3、把第3组母猪(背膘≥21mm)的仔猪,按照初生重分为4组,即1.0kg,1.0-1.4kg,1.4-1.6kg,1.6kg。结果发现:仔猪初生重1.0kg的胎盘血管密度显著低于正常体重组;胎盘组织胎盘脂质代谢相关的GPR120、ABHD5以及胎盘发育与血管生成相关的PPARγ、VEGFA的基因和蛋白的表达显著低于其他组(P0.01),但对应这些基因的mRNA m6A水平显著高于其他各组(P0.01),且胎盘组织中m6A水平与仔猪体重呈现显著的负相关;而m6A去甲基化酶FTO的蛋白水平显著低于其他各组(P0.01)。这些结果表明:在母猪妊娠期体脂过度沉积时,母猪胎盘脂质代谢以及胎盘发育相关基因mRNA上的m6A修饰程度增加,降低了这些基因在胎盘组织中的表达,最终影响了胎盘血管生成。因此,如何调节母猪妊娠期脂肪沉积尤为关键,以下两部分内容基于GPR120探讨调控母猪脂肪分化的作用机制。第二部分,猪GPR120不同转录本的鉴定及受体信号研究本研究通过克隆猪GPR120基因(pig GPR120,p GPR120),首次鉴定出p GPR120存在3种转录本,其中p GPR120的野生型(p GPR120 wild type,p GPR120-WT)是主要表达的亚型,在肠道、脾脏和成熟脂肪组织中高表达,并在母猪胎盘和血管内皮细胞中表达。接着,通过构建GPR120下游经典信号胞内钙离子信号([Ca2+]i)报告基因系统和胞外信号调节激酶(Extracellular Signal-Regulated Kinase,ERK1/2)报告系统,利用双荧光素酶报告系统,鉴定出p GPR120-WT可以很好的响应n-3 PUFA,如二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、α-亚麻酸(ALA)以及GPR120特异性激动剂TUG-891的刺激,而其他转录本受体不能被激活。n-3 PUFA也可以通过p GPR120-WT激活ERK1/2信号,上调ERK1/2的磷酸化水平。另外,利用上述两个报告基因系统开展受体显性抑制实验,结果表明,其他突变亚型并不能抑制p GPR120-WT的活性。第三部分GPR120调控脂肪分化的功能及机制研究1、采用成脂诱导培养基MDI对小鼠3T3L1前脂肪细胞进行分化诱导,收集0、0.5、1、2、4、6和8天的样品,QPCR检测了成脂关键基因的表达模式。结果发现:随着诱导的时间延长,GPR120、PPARγ和脂肪细胞脂肪酸结合蛋白4(FABP4,也称为a P2)的表达显著上调。猪脂肪组织血管基质细胞经MDI诱导后也呈现相似的结果。特别是在诱导两天之后,GPR120的表达显著上调。随后,在3T3L1细胞中,通过慢病毒干扰GPR120,油红O染色显著抑制脂肪分化;相应的,成脂相关基因PPARγ和a P2的表达也显著下调。2、用α-亚麻酸ALA和GPR120的特异性激动剂TUG-891分别处理MDI诱导2天的3T3L1细胞后,均显著增强PPARγ蛋白的表达,从而促进了成脂分化。当慢病毒干扰GPR120的表达后,ALA和TUG-891的处理并不能提高PPARγ的表达,也不影响脂肪分化的表型。利用PPARγ结合元件报告基因(PPARγResponse Element,PPRE)研究发现,ALA和TUG-891激活PPARγ是依赖于GPR120的。3、作为GPR120的另一种内源性激动剂,DHA也可以激活PPRE的活性,却抑制PPARγ的表达,从而抑制成脂分化的发生。4、为排除ALA脂肪酸本身对其他事件的影响,我们利用TUG-891研究下游信号通路,结果发现TUG-891可以很好的激活下游的[Ca2+]i-ERK1/2信号;当慢病毒干扰GPR120之后,TUG-891对上述信号的激活作用消失。5、进一步研究[Ca2+]i-ERK1/2信号在脂肪分化中的作用,TUG-891的处理可以上调成脂关键基因PPARγ和a P2的表达,并上调PPARγ蛋白的表达,从而促进脂肪分化。当添加[Ca2+]i-ERK1/2信号相应的抑制剂,BAPTA-AM和U0126处理时候,可以显著抑制TU-891对脂肪分化事件的激活作用。在不表达GPR120的HEK293T细胞,利用PPRE活性研究也证实了TUG-891通过[Ca2+]i-ERK1/2信号激活PPARγ,这一过程依赖于GPR120。综上所述,本研究的主要结论是:(1)母猪妊娠期肥胖显著增加仔猪弱仔发生率,其机制是:母体过度沉积体脂时,胎盘脂质沉积增加,导致胎盘组织中去甲基化酶FTO表达水平下调,胎盘RNA m6A修饰水平显著升高,从而抑制了血管生成关键基因GPR120、ABHD5、PPARγ和VEGF-A的表达,造成胎盘血管发育障碍,胎儿发育受阻。(2)猪GPR120参与了脂肪细胞生成的调控,其机制是:膜受体p GPR120被配基激活后,通过[Ca2+]i-ERK1/2信号通路,上调了细胞核中核受体PPARγ的表达,从而促进了脂肪分化。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S828
【部分图文】：

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图 2-5 妊娠末期不同背膘母猪中 LBW 猪胎盘中关键基因上 m6A 修饰水平n=3，a, b 同行数据无相同字母者表示差异显著（P< 0.05）。箭头表示胎盘中的血管。Fig. 2-5 Specific m6A modification level increased in the key genesn=3. a, b letters within a row denote statistical difference between means, P< 0.05.3.2 母猪妊娠期末期背膘过厚对不同体重仔猪胎盘发育的影响3.2.1 母猪妊娠末期背膘过厚对不同体重仔猪胎盘血管发育的影响实验室前期研究已经发现母猪背膘过厚是造成胎盘代谢异常的关键因素，因此，进一步分析妊娠末期背膘过厚母猪不同体重仔猪间的胎盘发育情况，如图2-6所示。结果表明，相比于其他体重的仔猪，LBW 组（体重<1.0kg 组）的仔猪胎盘中，脂质代谢相关基因 ABHD5，显著低于其他各组，长链脂肪酸感受体 GPR120 表达有下降的趋势，脂肪酸水解酶 ATGL 组间无差异。血管发育相关的 VEGFA、PPARγ 显著低于其他各组，血管生成负调控因子 Angpt2 组间无差异。值得注意的是，LBW 组仔

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GPR120 对肥胖母猪胎盘发育的影响及其参与脂肪分化调控的机制3.2.2 母猪妊娠期不同背膘下不同体重仔猪胎盘中 m6A 水平差异我们利用上述实验中建立的 LC-MS/MS方法检测了不同仔猪胎盘中m6A 修饰水平的变化，如图 2-7 所示。结果表明，LBW 仔猪胎盘中 m6A 水平显著高于其他各组，m6A 修饰水平与小猪体重之间存在显著的负相关。

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图 2-9 妊娠末期背膘过厚母猪不同体重仔猪胎盘中关键基因上 m6A 修饰水平n=3, a, b 同行数据无相同字母者表示差异显著（P< 0.05）。Fig. 2-9 Specific m6A modification level increased in the mRNA of the key genen=3 and a, b letters within a row denote statistical difference between means, P< 0.0猪妊娠末期背膘厚度对低初生重仔猪发生率的影响持母猪最佳体况对提高繁殖性能至关重要（Kim et al 2013）。在本研究了背膘过厚组 LBW 猪的百分比显着增加。因此，我们进一步关注三 LBW 猪的发生。与其他组相比，母体肥胖的 LBW 猪胎儿血管密度较是血管生成相关基因的 m6A 修饰增加，降低了其表达造成的。研究中，妊娠 109d 时，背膘厚≥21mm 组增加了出生重≤0.9g 和≤例。这与已有的报道数据一致（Torres-Rovira et al 2013）。Torres-Rovira

【参考文献】