H3N2亚型猪流感病毒的分离鉴定及其灭活疫苗免疫效力评价

发布时间：2020-09-28 18:28

　　猪流行性感冒(Swine influenza,SI)是由A型流感病毒引起的一种急性、热性、高度接触性感染的呼吸道传染病。其临床症状为突然发病、咳嗽、喷嚏、流涕、呼吸困难、发热、衰竭、食欲下降和生长缓慢等。该病发病率高、传染性强,单纯感染时死亡率并不高,但在短时间内可波及全群,对猪的生长性能造成不良的影响;若与其他病原混合感染,会使死亡率增高,给养猪业造成严重的经济损失。目前对于猪流感的防控主要通过免疫接种进行,但我国市场上猪流感疫苗的种类非常少,且交叉保护力不强。本研究通过分离国内流行的H3N2亚型猪流感病毒,针对灭活剂及佐剂进行优化,并制备成灭活疫苗,同时对该灭活疫苗进行免疫效力的评估,以提供一种安全有效的猪流感灭活疫苗,减少本病对养猪业造成的经济损失。本研究从黑龙江省某猪场采集的疑似猪流感发病猪的鼻拭子13份,经过处理后,接种至10~11日龄SPF鸡胚,分离到一株具有血凝性的病毒。通过血清学鉴定、分子生物学鉴定、电镜观察、生物学特性及理化特性等方法对该病毒进行鉴定,结果可见分离株对鸡红细胞的凝集价为1:256,且仅能被H3亚型猪流感阳性血清中和,RT-PCR鉴定结果为H3、N2亚型;电镜下病毒粒子呈球形,直径约为80~120nm,有囊膜,表面有刺突和纤突,对鸡胚的半数感染量(EID_(50))为10~(-6.38)EID_(50)/0.1mL;该病毒对热、氯仿以及乙醚均敏感;从上述对病毒特性的研究,判定分离的病毒为H3N2亚型猪流感病毒。利用10~11日龄SPF鸡胚制备制苗用病毒液,用终浓度为0.2%二乙烯亚胺(BEI)灭活病毒,将其乳化制成油乳剂灭活疫苗,用血清学方法和免疫攻毒方法对该疫苗的免疫效力进行评估,并测定了疫苗的免疫期。结果可见该灭活疫苗的免疫效力良好,与市售猪流感灭活疫苗比较,可见两者免疫期相同,且本疫苗的免疫效力在一定程度上优于市售疫苗。由此可见该毒株可以作为一株优质的制苗用备选毒株,为猪流感疫苗的研制奠定基础。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.4
【部分图文】：

结构示意图,囊膜

东北农业大学兽医硕士学位论文ine/ACheng/5/2016(H3N2)[24]。猪流感病毒（Swine influenza Virus，SIV）粒子呈多形性，在初次分离时为丝状，一，经鸡胚培养传代后均呈球状，直径约为 80～120 nm[25,26]。病毒具有囊膜，囊膜定病毒吸附红细胞功能的血凝素（haemagglutinin，HA）和帮助新病毒粒子从细胞来的神经氨酸酶（neuraminidase，NA）两种刺突状糖蛋白以及跨膜的基质蛋白（ins，M2）组成，HA 约为 NA 的 4～5 倍[27]。基质蛋白 M1 位于囊膜类脂双层内侧外侧，以维持病毒形态。病毒的核衣壳由核蛋白（nucleoprotein, NP）构成，其内含 RNA、三种聚合酶蛋白（PB1、PB2、PA）以及非结构蛋白（nonstructural proteinsPB2、PA 的分子质量在流感病毒各亚单位蛋白中是最大的，且在被感染的细胞的，均发现了 PA、PB2 和 PB1 成分。NS 由 NS1 和 NS2 组成，当病毒感染细胞后，检出大量 NS1、胞浆内可检出大量 NS2，但病毒粒子中则不再存在[28-32]。病毒基本图见图 1-1[33]。

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好的病料上清液，接种于 10~11 日龄 SPF 鸡胚，接种量为 0.2ml/胚，35℃持为 60~65%）培养，每日检胚 2 次，弃去 24h 内死亡的鸡胚，24h 后死亡至 72h 取出全部鸡胚，置 2~8℃冷却 12h，收获鸡胚尿囊液，进行红细胞份病料接种的鸡胚盲传 2 代时，收获的鸡胚尿囊液出现红细胞凝集，效价为释法接种 10~11 日龄鸡胚检测半数鸡胚感染量为 10-5.68EID50/0.1ml，结果见的胚体出现水肿、出血点等病理变化，结果见图 3-1。表 3-1 病毒 EID50测定结果Tab .3-1 Results of virus EID50measurement度tion接种鸡胚数Inoculation holesCPE+CPE－积累Accumulation CPE 率百分PerceCPE+CPE－5 5 0 11 0 11/11 105 4 1 6 1 6/7 855 2 3 2 4 2/6 335 0 5 0 9 0/9 0

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东北农业大学兽医硕士学位论文明所分离的毒株为 H3 亚型猪流感病毒，并将该分离株命名为 AC 株。表 3-2 红细胞凝集抑制试验鉴定结果Tab.3-2 The indentification result of Hemagglutination inhibition test代次generation阳性抗血清Positive antiserumH1 H3 H5 H9F5 - + - -注：“+”阳性反应；“-”阴性反应Note:“+”positive reaction, “-”negative reaction..2.2 病毒的分子生物学鉴定将猪流感病毒 AC 株用所合成的引物进行流感病毒亚型的鉴定。由图 3-2, 3-3 可以看出 H3 U/L、和 N2 U/L 扩增出了与预期扩增片段大小一致的条带，表明该样品的 HA 为 H3型，NA 为 N2 亚型。

【参考文献】