羊口疮病毒B2L基因的原核表达及纯化

发布时间：2020-09-30 09:48

　　 为获取羊口疮病毒B2L基因编码蛋白,本研究根据GenBank上羊口疮病毒ORFV/ShanXi/2011/China株B2L基因序列,设计并合成—对特异性引物,利用PCR方法扩增ORFV/QD/2015株B2L基因,并将扩增的B2L基因克隆到PMD18-T载体上,构建重组质粒(PMD18-T-B2L)。应用生物信息学相关软件及方法对所得的基因进行序列分析,并对其编码蛋白的二级结构、B细胞抗原表位、三级结构、跨膜结构域和信号肽等进行预测和分析。最后将目的基因亚克隆到PET-32a(+)载体上,获得重组质粒PET-32a-B2L,通过双酶切和测序进行鉴定正确的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。将重组菌于37℃、终浓度含1mM IPTG的LB培养基中诱导表达3h后进行SDS-PAGE分析,表达的目的蛋白经过层析纯化后,进行Western Blot鉴定。结果显示,ORFV/QD/2015株B2L基因序列长1137 bp,编码379个氨基酸;该毒株与国内外其他12株羊口疮病毒参考株的B2L基因核苷酸序列同源性为96.8%-99.7%,氨基酸序列同源性为96.8%-99.2%;B2L基因的系统进化分析显示,ORFV/QD/2015 株与 2015 年分离到的 ORFV/ShaanXi/2015/China 株亲缘关系最近;B2L基因编码蛋白二级结构以α-螺旋区域和β—折叠区域所占比例较大,预测此蛋白可能存在7个B细胞优势抗原表位,无跨膜区域,无信号肽区域;三级结构呈弯曲状螺旋结构。原核表达载体PET-32a-B2L构建成功;SDS-PAGE鉴定发现目的条带的分子量与预期大小相符;纯化的目的蛋白经Western Blot鉴定正确,表明蛋白表达成功。本研究成功构建了羊口疮病毒B2L基因原核表达重组质粒,并成功表达和纯化了 B2L蛋白,为后续羊口疮病毒检测方法的建立打下了基础。
【学位单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

副痘病毒和牛丘疹性口炎病毒等［４］。羊口疮病毒经过１邋％的磷钨酸负染后，通过透射逡逑电镜观察，发现病毒粒子比较大，长２５０－２８０邋ｎｍ，宽１７０－２００邋ｎｍ％大多数呈椭圆形的逡逑线团样，也有砖型、维形和特殊的线团样球形粒子，如图１所示。在超薄切片中，病逡逑毒粒子的外层被较厚的囊膜包裹着，内部是卵圆形或者圆锥形核心，核心两侧是侧体，逡逑如图２所示。常可以在感染的细胞胞浆中看到病毒粒子被较厚的双层囊膜包裹，表面逡逑呈“８”字型螺旋状结构Ｍ］。逡逑［ｍｕＢ逡逑ｍｍ逡逑ＥＷｉｐ＾逡逑图１病毒粒子在透射电镜下的形态（６００００Ｘ）（引自２０１６年涂明亮论文）逡逑Ｆｉｇ邋１邋Ｔｈｅ邋ＯＲＦＶ－Ｑ邋Ｖｉｒｕｓ邋ｐａｒｔｉｃｌｅｓ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｕｎｄｅｒ邋ｔｈｅ邋ｅｌｅｃｔｒｏｎ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ邋（６００００邋ｘ）逡逑

３．邋６邋０ＲＦＶ／ＱＤ／２０１５株Ｂ２Ｌ基因编码蛋白的二级结构预测逡逑运用ＤＮＡＳｔａｒ程序中的Ｐｒｏｔｅａｎ软件，使用Ｇａｍｉｅｒ－Ｒｏｂｓｏｎ和Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎ两种逡逑方法，对ＯＲＦＶ／ＱＤ／２０１５株Ｂ２Ｌ基因编码蛋白的二级结构进行分析，结果见图１１。逡逑由图１１可知，不同预测方法对蛋白二级结构的分析结果不完全相同，Ｐ－折叠和Ｐ－转逡逑

２４逦羊口疮病毒Ｂ２Ｌ基因原核表达及纯化逦逡逑逦逦逦逦逦逦ｔ逦！逦，逦，逦，逦，逦，逦，逦１逦，逦，■逦！逦１逦１邋Ｐ＆Ｓ３＞ｅ逡逑－ＴＳＤ邋２－Ｘ＇邋２２＞逦２４０逦２Ｓ０逦Ｋ＞５邋３２Ｓ逦３４３逦３＜Ｄ逡逑

【参考文献】

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本文编号：2830676