姜黄素通过上调Nrf2-GST表达干预AFB1诱导的肉鸡亚急性肝损伤
发布时间：2020-09-30 15:47
黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,简称AFB1)是黄曲霉毒素(AF)中的一种,AFB1因其肝毒性强、危害大、分布广而被列入一级致癌物。AFB1为前致癌物,进入体内经Ⅰ相药物代谢酶催化代谢为黄曲霉毒素B1-8,9-环氧化物(AFBO),肝脏为其主要靶器官,可造成肝损伤,甚至诱发肝癌。肝脏结合解毒是消除代谢物毒性的主要方式,其中谷胱甘肽-S-转移酶(GST)是肝脏的主要解毒酶,而黄曲霉毒素B1-8,9-环氧化物-谷胱甘肽加合物(AFBO-GSH)是评价GST能否解毒AFB1的主要指标之一。姜黄素(curcumin)是姜黄的活性成分,具有抗炎、抗氧化及提高机体免疫力等功效,可激活Nrf2-ARE通路对抗氧化应激,但其作用机制尚不明确,尤其是姜黄素能否通过促进肝脏的解毒机制干预AFB1的肝毒性未见报道。本实验选择国内饲养量大的Arbor Acres(AA)肉鸡作为实验动物,从mRNA、蛋白质表达水平、酶活性三个层次来探讨AFB1对肉鸡肝脏Nrf2和主要II相解毒酶表达的影响及添加姜黄素对AFB1造成上述影响的改变。并采用高效液相色谱法检测加合物AFBO-GSH含量的变化以此来评价GST的解毒能力。本研究将阐明AFB1致肉鸡亚急性肝损伤和姜黄素如何影响核因子NF-E2相关因子(Nrf2)及其下游靶基因GSTA家族与GSTM家族部分亚型(GSTA、GSTA3、GSTA4和GSTM2)、环氧化物水解酶1型(EPHX1)的表达,从而缓解AFB1诱导的肉鸡亚急性肝损伤作用。研究结果如下:1、AFB1和/或姜黄素对肉鸡肝脏Nrf2及II相酶(GST、EPHX1)的影响本实验采用病理组织学切片法(HE染色)、RT-PCR和Western-Blot法,研究了饲料中连续添加AFB1(5 mg·kg~(-1))及不同剂量姜黄素(150 mg·kg~(-1)、300 mg·kg~(-1)和450 mg·kg~(-1))28d对AA肉鸡肝脏Nrf2及相关II相解毒酶(GSTs、EPHX1)的影响。结果显示,连续染毒28d,AFB1组肉鸡Nrf2基因及蛋白表达极显著低于空白对照组(P0.01);II相酶GSTA、GSTA3、GSTA4、GSTM2和EPHX1基因表达极显著低于空白对照组(P0.01);GSTA3蛋白表达极显著低于空白对照组(P0.01);病理组织切片结果显示,AFB1组肉鸡肝细胞变性坏死现象严重,表明AFB1对肉鸡肝脏造成损伤,而姜黄素干预组肉鸡肝组织AFB1损伤症状被显著缓解,且缓解程度与姜黄素剂量呈正相关,表明姜黄素对AFB1诱导的肝损伤有保护作用。姜黄素对照组与空白对照组相比各项指标未见显著差异(P0.05),说明添加的姜黄素浓度对肉鸡无不良影响。与AFB1染毒组相比,中、高剂量姜黄素能够极显著提高Nrf2及II相酶GSTs、EPHX1基因的表达(P0.01);高剂量姜黄素能够极显著提高Nrf2、GSTA3及GSTM2蛋白的表达(P0.01),说明姜黄素是通过提高Nrf2及其下游II项酶通路的表达来抵抗AFB1诱发的氧化应激及其肝损伤。停止染毒及姜黄素干预后第7d(即实验第35d),各组肝脏指标变化趋势与28d相似,AFB1组AA肉鸡肝脏仍呈现明显的肝损伤状态,高剂量姜黄素对AFB1诱导的AA肉鸡亚急性肝损伤仍存在持续的保护作用。说明AFB1对肉鸡肝脏Nrf2及II相酶(GST、EPHX1)的影响在停毒7d内具有后遗毒性,而且姜黄素的干预作用在停药7d内有持续性。2、AFB1及姜黄素对肉鸡肝脏GST活性及其催化AFBO解毒能力的影响连续染毒28d,与空白对照组相比,肉鸡肝组织内GST酶活性极显著降低(P0.01),姜黄素干预组与AFB1组相比,GST酶活性有所提高但未见显著差异。将肉鸡肝微粒体分别与丁基羟基茴香醚(BHA)诱导小鼠肝胞液、对照组肉鸡肝胞液、添加姜黄素肉鸡肝胞液及不添加肝胞液放入缓冲液中进行反应,采用高效液相色谱法对上清液中加合物进行分析检测。结果显示仅在添加姜黄素的一组上清液中检测到AFBO-GSH加合物。停毒停药7d后,各组GST酶活性趋势及AFBO-GSH加合物检测结果与28d相似。说明姜黄素提高了肉鸡肝组织GST酶活性,促进谷胱甘肽(GSH)与AFBO的结合,从而起到解毒作用,并且其干预作用在停药7d内有持续性。以上结果表明,连续28d饲喂含有5 mg·kg~(-1) AFB1的饲料能够造成AA肉鸡亚急性肝损伤,且损伤不可逆;肉鸡体内共检测到以下参与解毒的II相酶亚型:GSTA、GSTA3、GSTA4、GSTM2和EPHX1;姜黄素通过上调Nrf2及上述II相酶的表达,促进AFBO与GSH结合解毒改善AFB1诱导的肝损伤,以高剂量干预效果最佳,这是姜黄素缓解AFB1致AA肉鸡肝损伤的作用机制之一。建议姜黄素混饲的干预剂量为450 mg·kg~(-1)。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S858.31
【部分图文】：
图 1-1 黄曲霉毒素 B1 的体内代谢Fig. 1-1 The metabolism of AFB1 in body1.4 本研究目的与意义在前文介绍中提到，AFB1 经 I 相酶催化生成 AFBO，进而发挥毒性。本研究团队经前期预实验摸索 AFB1 致 AA 肉鸡亚急性肝损伤模型及 AFB1 染毒剂量，确立了在实验用鸡建立制造肉鸡亚急性肝损伤模型的染毒剂量为 5 mg·kg-1。在此基础上，本课题组其他成员针对肉鸡氧化 AFB1生成 AFBO 的 I 相酶进行了深入研究，经过研究证实在肉鸡体内能催化 AFB1 生成 AFBO 的 I 相酶主要有 CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6 和 CYP3A4。在 AFB1 致肉鸡肝损伤后参与解毒的是 GST哪一种亚型，环氧化物水解酶能否有效参与解毒，以及 Nrf2 在其中是否有参与，这些都未见报道，并且在姜黄素干预后起到的缓解作用是否与 II 相酶相关，这些都是本研究中主要需要解决的问题。本课题以 Arbor Acres 肉鸡为实验动物，建立 AFB1 亚急性肝损伤模型并以高、中、低三种剂量姜黄素进行干预，利用 Real-time PCR、Western Blot、高效液相色谱法、病理组织学分析、酶活性等分子生物学及现代病理学技术，观察肝细胞病理变化，检测 Nrf2、GST 和 EPHX1 基因及蛋白的表达变化，进而探索 AFB1 致肉鸡肝损伤后参与解毒的 GST 亚型、EPHX1 是否有参与解毒及Nrf2在其中扮演的角色，评价姜黄素在这一解毒过程中所起到的干预作用。本研究为AFB1
20注：红圈为病变部位。图 A 为空白对照组，图 B 为 AFB1 染毒组；图 C 为姜黄素对照组，图 D 为姜黄素低剂量干预组，图 E 为姜黄素中剂量干预组，图 F 为姜黄素高剂量干预组。Note: The red ring refers to the lesion sites. A represents control group, B represents AFB1 group. C represents curcumincontrol group, D represents curcumin high dose group, E represents curcumin medium dose group, F represents curcuminlow dose group.图 3-1 28 d 各处理组 AA 肉鸡肝脏病理组织学切片（HE 染色，400×）Fig. 3-1 Histological section of six groups’ AA broilers on 28th day（HE staining, 400×）
21注：红圈为病变部位。图 A 为空白对照组，图 B 为 AFB1 染毒组；图 C 为姜黄素对照组，图 D 为姜黄素低剂量干预组，图 E 为姜黄素中剂量干预组，图 F 为姜黄素高剂量干预组。Note: The red ring refers to the lesion sites. A represents control group, B represents AFB1 group. C represents curcumincontrol group, D represents curcumin high dose group, E represents curcumin medium dose group, F represents curcuminlow dose group.图 3-2 35 d 各处理组 AA 肉鸡肝脏病理组织学切片（HE 染色，400×）Fig. 3-2 Histological section of six groups’ AA broilers on 35th day（HE staining, 400×）
本文编号：2831028
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S858.31
【部分图文】：
图 1-1 黄曲霉毒素 B1 的体内代谢Fig. 1-1 The metabolism of AFB1 in body1.4 本研究目的与意义在前文介绍中提到，AFB1 经 I 相酶催化生成 AFBO，进而发挥毒性。本研究团队经前期预实验摸索 AFB1 致 AA 肉鸡亚急性肝损伤模型及 AFB1 染毒剂量，确立了在实验用鸡建立制造肉鸡亚急性肝损伤模型的染毒剂量为 5 mg·kg-1。在此基础上，本课题组其他成员针对肉鸡氧化 AFB1生成 AFBO 的 I 相酶进行了深入研究，经过研究证实在肉鸡体内能催化 AFB1 生成 AFBO 的 I 相酶主要有 CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6 和 CYP3A4。在 AFB1 致肉鸡肝损伤后参与解毒的是 GST哪一种亚型，环氧化物水解酶能否有效参与解毒，以及 Nrf2 在其中是否有参与，这些都未见报道，并且在姜黄素干预后起到的缓解作用是否与 II 相酶相关，这些都是本研究中主要需要解决的问题。本课题以 Arbor Acres 肉鸡为实验动物，建立 AFB1 亚急性肝损伤模型并以高、中、低三种剂量姜黄素进行干预，利用 Real-time PCR、Western Blot、高效液相色谱法、病理组织学分析、酶活性等分子生物学及现代病理学技术，观察肝细胞病理变化，检测 Nrf2、GST 和 EPHX1 基因及蛋白的表达变化，进而探索 AFB1 致肉鸡肝损伤后参与解毒的 GST 亚型、EPHX1 是否有参与解毒及Nrf2在其中扮演的角色，评价姜黄素在这一解毒过程中所起到的干预作用。本研究为AFB1
20注：红圈为病变部位。图 A 为空白对照组，图 B 为 AFB1 染毒组；图 C 为姜黄素对照组，图 D 为姜黄素低剂量干预组，图 E 为姜黄素中剂量干预组，图 F 为姜黄素高剂量干预组。Note: The red ring refers to the lesion sites. A represents control group, B represents AFB1 group. C represents curcumincontrol group, D represents curcumin high dose group, E represents curcumin medium dose group, F represents curcuminlow dose group.图 3-1 28 d 各处理组 AA 肉鸡肝脏病理组织学切片（HE 染色，400×）Fig. 3-1 Histological section of six groups’ AA broilers on 28th day（HE staining, 400×）
21注：红圈为病变部位。图 A 为空白对照组，图 B 为 AFB1 染毒组；图 C 为姜黄素对照组，图 D 为姜黄素低剂量干预组，图 E 为姜黄素中剂量干预组，图 F 为姜黄素高剂量干预组。Note: The red ring refers to the lesion sites. A represents control group, B represents AFB1 group. C represents curcumincontrol group, D represents curcumin high dose group, E represents curcumin medium dose group, F represents curcuminlow dose group.图 3-2 35 d 各处理组 AA 肉鸡肝脏病理组织学切片（HE 染色，400×）Fig. 3-2 Histological section of six groups’ AA broilers on 35th day（HE staining, 400×）
【参考文献】
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本文编号：2831028
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