PRRSV抗体差异猪外周血单核细胞的转录组及全基因组DNA甲基化调控研究

发布时间：2020-09-30 17:00

　　猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)导致的一种高度接触性传染疾病,其主要典型特征为母猪繁殖障碍及仔猪呼吸困难,临床上造成大规模流产、死胎及仔猪死亡,给养猪业造成巨大的经济损失。在当前养猪生产实践中,免疫预防是猪场防控PRRS以降低生产损失的主要策略。但猪的PRRSV免疫效率不一,抗体保护作用有限,主要原因是目前关于猪PRRSV免疫应答不稳定的分子机制尚不清楚。本研究采用全基因组转录组测序(RNA-seq)和甲基化测序(MeDIP-seq)的策略,探究连续两代猪PRRSV免疫后不同抗体应答水平个体外周血单核细胞(PBMCs)中的基因表达、DNA甲基化状态变化以及DNA甲基化对免疫相关基因表达的调控机制,以期从表观遗传学角度揭示差异免疫应答的调控机理,为猪PRRS的预防免疫及抗病育种提供新的依据。试验1:通过RNA-seq鉴定妊娠母猪PRRSV不同抗体应答水平相关候选基因。本试验以4头具有高抗体应答水平、4头中抗体应答水平和4头低抗体应答水平长白妊娠母猪PBMCs为试验材料。通过RNA-seq分析,共得到401个差异表达基因(q0.05)。其中上调差异表达基因91个,下调差异表达基因310个。差异表达基因GO分析和通路分析结果显示差异表达基因富集在炎症反应、创伤反应、细胞因子生成调控、防御应答、细胞程序性凋亡调控、细胞增殖、白细胞趋化和迁移及免疫系统进程等生物学过程。整合差异表达基因和QTL数据分析,得到11个抗体应答候选基因,包括MEGF9,NDRG1,SLA-8,C2,STX11,C-JUN,FOS,NFKBIA,TNF-α,IL-1α,IL-1β。试验2:通过RNA-seq鉴定仔猪PRRSV不同抗体应答水平相关候选基因。为进一步探索母猪抗体应答水平差异与其仔猪免疫应答的关联,在母猪高抗组所产的仔猪中选择出高抗体水平的仔猪,母猪低抗组所产的仔猪中选择出低抗体水平的仔猪,本试验以3头具有高抗体应答水平和3头低抗体应答水平仔猪PBMCs为试验材料。通过RNA-seq分析,获得86个差异表达基因(q0.05)。整合差异表达基因、前期母猪免疫应答研究结果和前人已报道的猪PRRSV免疫应答转录组数据比较分析,获得6个仔猪抗体应答候选基因C-JUN,FOS,CCL4,TNF-α,NFKBIA,IL7R。通过MeDIP-seq技术构建不同抗体应答水平仔猪PBMCs全基因组甲基化图谱,结果表明,高抗组仔猪在CpG密度为10-15个CpGs/kb区域具有更高的甲基化水平,低抗组仔猪CpG密度为15-20个CpGs/kb区域具有更高的甲基化水平;低抗组仔猪CpG岛甲基化水平高于高抗组。通过启动子区差异甲基化基因与差异表达基因重叠分析,显示6个基因(PYY,CCR7,IL7R,CD59,RHOB,VASH1)的启动子甲基化水平与基因表达量呈负相关。试验3:连续两代猪PRRSV不同抗体应答水平个体转录组同质性分析。本试验以试验1和试验2为材料,通过对母猪与其仔猪PBMCs转录组进行同质性分析,发现在两代猪中TNF-α,CCL 和NFKBIA基因的表达量与PRRSV抗体水平呈负相关,并用RT-qPCR技术进行母猪活体验证了此结果。本研究对两代猪PRRSV不同抗体应答水平PBMCs转录组和全基因组DNA甲基化分析,对PRRSV抗体免疫应答方面表观遗传学调控研究及组织特异性的甲基化水平分析研究提供了参考数据。
【学位单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S858.28
【部分图文】：

猪繁殖与呼吸综合征,图片,灭活疫苗

比如ＲＴ－ＰＣＲ、原位ＰＣＲ、巢式ＰＣＲ及核酸探针技术可以直接鉴定病料组织中的ＰＲＲＳＶ。逡逑１．１．２．４猪繁殖与呼吸综合征的防治逡逑目前，ＰＲＲＳ在世界呈广泛流行的趋势（图１－２），如何有效的防治ＰＲＲＳ，已成为世界逡逑养猪业的一大难题。有关各国都在积极探索新的策略以控制ＰＲＲＳ，但成效并不显著，给逡逑ＰＲＲＳ的防治工作造成困难的因素主要为免疫抑制、持续感染、亚临床感染及容易继发a|染逡逑等。因为没有特效药物能治疗ＰＲＲＳ，预防免疫仍是防控ＰＲＲＳ的有效措施，并对此寄予厚逡逑望。现在预防本病的疫苗主要是灭活疫苗和弱毒活疫苗。使用灭活疫苗免疫时，因诱导产生逡逑的免疫反应持续时期短，常需进行多次免疫。与灭活疫苗相比之下，弱毒疫苗诱导的免疫反逡逑应持续时间更长，并且效果更好。但是，ＰＲＲＳＶ所产生的免疫应答反应，在引发自身免疫逡逑力和抵抗力、保护机体避免受到感染的同时，也可能造成病理过程、激化继发感染，因此，逡逑有人形象地称之为“双刃剑”邋２４。逡逑３逡逑

序列,甲基化,基因沉默,非编码

色体的失活、基因印记、基因表达调控、胚胎发育和肿瘤的发生发展均发挥着至关重要的作逡逑用。在甲基转移酶的催化作用下，基因组ＤＮＡ甲基模式得以建立与维持，并由甲基化ＣｐＧ逡逑结合蛋白识别甲基化信息。如图１－４所示，哺乳动物中常见ＤＮＡ甲基转移酶主要分为Ｄｒｎｎｔｌ、逡逑Ｄｎｍｔ３ａ和Ｄｎｍｔ３ｂ，其中Ｄｎｍｔｌ的功能主要是维持ＤＮＡ甲基化状态，艮Ｐ以母本链甲基化信逡逑息为模板，建立ＤＮＡ半保留复制所产生的子代新链的甲基化模式５５；邋Ｄｎｍｔ３ａ和Ｄｎｍｔ３ｂ的逡逑功能主要是使ＤＮＡ重新甲基化，即催化非甲基化的ＤＮＡ序列到从头甲基化（ｄｅｎｏ逡逑ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）的发生５６。这些甲基化转移酶在胚胎和婴儿发育过程中是不可或缺的酶类，其逡逑中Ｄｎｍｔ３ａ基因还会对造血干细胞的分化造成影响，并且该基因敲除的小鼠在出生几周后无逡逑法存活５７，５８。这些结果说明了邋ＤＮＡ甲基化在脊椎动物分化发育过程中有着关键作用。逡逑８逡逑

甲基化模式,哺乳动物,甲基化,染色质构象

图１－５哺乳动物典型的ＤＮＡ甲基化模式（Ｉｌｌｉｎｇｗｏｒｔｈ邋＆邋Ｂｉｒｄ２００９）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－５邋Ｔｙｐｉｃａｌ邋ＤＮＡ邋ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ邋ｌａｎｄｓｃａｐｅ邋ｉｎ邋ｍａｍｍａｌｓ邋（Ｉｌｌｉｎｇｗｏｒｔｈ邋＆邋Ｂｉｒｄ邋２００９）逡逑基因启动子区发生甲基化后，影响基因转录的机制主要有四种（图１－６）：邋ａ）甲基基团逡逑深入到ＤＮＡ双螺旋大沟内所造成的空间位阻能够阻碍转录因子与识别序列的结合；ｂ）邋ＣｐＧ逡逑甲基化结合蛋白（ＭｅＣＰｌ、ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２等）结合到甲基化ＣｐＧ位点，可以募逡逑集共抑制复合物到甲基化位点上，改变染色质构象，从而抑制基因转录；ｃ）ＤＮＭＴ酶与组逡逑蛋白去乙酰化酶或组蛋白甲基化转移酶结合形成较为紧密的染色质构象而直接抑制转录；ｄ）逡逑甲基化ＣｐＧ结合蛋白结合在基因本体甲基化位点上，直接或通过影响相邻染色质构象而阻逡逑碍转录的延伸６８。逡逑（ａ）逦（ｂ）逡逑（ｃ）逦Ａｃ逦（ｄ）逡逑［＼邋0ＮＭＴ邋Ｊｆ邋ｒ＾Ｈ３－Ｍｅ逦ｆ—？逦ＣＨ３逡逑＾ＣＨ３逦ｍｓ逡逑图１－６邋ＤＮＡ甲基化抑制基因转录的分子机制（Ｋｌｏｓｅ＆邋Ｂｉｒｄ邋２００６）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－６邋Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ邋ｏｆ邋ＤＮＡ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ邋（Ｋｌｏｓｅ邋＆邋Ｂｉｒｄ邋２００６）逡逑１．２．２．３基因本体白勺ＤＮＡ甲基化逡逑大多数基因本体（ｇｅｎｅ邋ｂｏｄｙ）缺乏ＣｐＧ岛，但其甲基化的现象却广泛存在。基因本体逡逑甲基化对基因转录的影响目前还没有明确的结论。基因本体内，夕卜显子的甲基化程度比内含逡逑子较高

【参考文献】