贾第虫α-15-贾第素蛋白免疫荧光定位及两种虫株表达差异研究

发布时间：2020-10-01 18:30

　　十二指肠贾第鞭毛虫(Giardia duodenalis)属于全球范围内的寄生虫。在亚洲、非洲、拉丁美洲每年大约2亿人感染贾第虫,并且表现出一定的临床症状。因为具有人畜共患性,现已列入全世界危害人类健康的10种主要寄生虫病之一。贾第虫主要是通过排出具有感染性的包囊,使得其他宿主经消化道引起感染,能引起腹泻、头晕、体重减轻。宿主范围广泛,感染人、猴子等灵长类,牛、羊、猪等家畜,鸽子、鹦鹉等鸟类,犬、猫等伴侣动物、狐狸、老虎等野生动物在内的多种脊椎动物,此外,贾第虫还可感染鱼、两栖动物、爬行动物、啮齿动物。经国内外报道,随着旅游业的发展,贾第虫也成为了旅行者腹泻的常见致病原。因此,作为重要的人畜共患病原体,贾第虫在受到越来越高的关注。细胞骨架是真核生物特有的特征之一,贾第虫作为最原始的真核生物,多种多样的细胞骨架蛋白是令人震惊的,贾第素就属于贾第虫中含量丰富的骨架蛋白,与贾第虫的吸附、入侵及感染有着密不可分的关系。同时,它也成为了人们研究真核生物的模型。贾第虫分为携病毒株和无病毒株滋养体,贾第虫病毒是专性存在于贾第虫体内的一种双链RNA病毒,贾第虫病毒能感染无病毒株,虽然国内外对于贾第虫的流行病学调查研究很多,但是对贾第虫病毒的研究却不多,其感染过程及对无病毒株的影响都研究甚少,具体机理都不清楚。贾第虫病毒具有感染性,感染5×10~5不会影响虫体的正常状态。因此,近年来,贾第虫病毒作为载体的用途越来越广泛。贾第虫病毒及他的外转录体都具有感染性。衣壳蛋白是主要的表达蛋白。贾第虫病毒感染无病毒株滋养体,引起虫体蛋白质的变化以及其他物质的变化都还不清楚。α贾第素作为贾第虫重要的骨架成分,在与贾第虫病毒之间应该会有某种关系。本研究根据GenBank中α-15-giardin序列设计引物,培养贾第虫至满瓶,进行收集虫体及提取了总RNA,反转录得到cDNA。以cDNA为模板扩增α-15-giardin基因,成功构建了大肠杆菌重组表达质粒pGEX-4T-α-15,将其转化到感受态细胞BL21。经IPTG诱导进行pGEX-4T-α-15融合蛋白的原核表达。通过SDS-PAGE实验分析其表达形式,利用切胶法获得较纯的融合蛋白。将纯化的蛋白进行免疫小鼠,制备了多克隆抗体,对α-15-贾第素蛋白在贾第虫中进行定位,然后在携病毒株与无病毒株滋养体进行α-15-贾第素蛋白的荧光相对定量PCR检测,以及将携病毒株和无病毒株滋养体进行总蛋白的提取,用制备的多抗作为一抗进行Western Blot试验。通过免疫小鼠,获得了效价高达1:51200、特异性高的免疫血清。荧光定位试验结果发现其位于贾第虫的细胞质,靠近细胞质膜的部位多一些,腹吸盘的位置几乎没有分布。荧光相对定量PCR试验结果为α-15-贾第素蛋白在携病毒株滋养体中mRNA表达量是无病毒株的滋养体表达量的8-10倍。Western Blot试验结果与mRNA表达结果一致,α-15-贾第素蛋白在携病毒株滋养体中蛋白表达量高于无病毒株的滋养体表达量。此研究对于α-15-贾第素蛋白在贾第虫体内的作用及贾第虫病毒与贾第素之间的关系、对贾第虫新药靶点的开发和贾第虫的诊断预防具有重要意义。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.7
【部分图文】：

贾第虫,总RNA提取,犬贾第虫,无病毒

A：犬贾第虫携病毒株总 RNA B：犬贾第虫无病毒株总 RNAA: Total RNA of G.canis with virus; B: Total RNA of G.canis without virus图 3-1 贾第虫总 RNA 提取结果Fig. 3-1 Results of total RNA extraction of Giardia-giardin 基因扩增结果iardin 基因 PCR 扩增后经 1%琼脂糖凝胶电泳（图 3-2）可见约 912 bp与预期相符。M：DNA marker DL2000； 1：α-15-giardin 基因 PCR 产物

电泳图,犬贾第虫,PCR扩增产物,电泳图

犬贾第虫携病毒株总 RNA B：犬贾第虫无病毒株总 RNA of G.canis with virus; B: Total RNA of G.canis wit图 3-1 贾第虫总 RNA 提取结果Fig. 3-1 Results of total RNA extraction of Giardia 基因扩增结果 PCR 扩增后经 1%琼脂糖凝胶电泳（图 3-2）可见符。

融合蛋白,抗血清

M：预染蛋白 Marker；1：纯化后的 pGEX-4T-α-15-giardin 融合蛋白Prestained protein Marker; 1: Purified pGEX-4T-α-15-giardin fusion pr图 3-7 pGEX-4T-α-15-giardin 融合蛋白的纯化Fig. 3-7 Purification of pGEX-4T-α-15-giardin fusion protei价的测定ISA 方法，倍比稀释抗血清检测制备的小鼠抗血清效价。 1：51200。说明 α-15-giardin 融合蛋白在小鼠体内诱导验要求。异性分析合蛋白作为抗原，制备的多克隆抗体作为一抗进行 Wes显示，出现一条约为 59 kDa 的特异性条带（见图 3-8）59 kDa 的 α-15-giardin 融合蛋白。

【参考文献】