TET3在牛早期胚胎发育过程中的作用研究

发布时间：2020-10-01 14:54

　　 DNA甲基化是真核生物基因组中主要的表观遗传修饰之一,其在许多生物过程(包括胚胎发育)中起到调节基因表达的作用。基因组DNA甲基化图谱由DNA甲基化和DNA去甲基化这两个双向、可逆过程维持形成,其动态变化对于哺乳动物胚胎的早期发育至关重要。目前,已经提出了DNA去甲基化的复制依赖性“被动”模型和复制无关的“主动”模型。DNA被动去甲基化是通过DNA复制介导的稀释而发生的,而主动去甲基化则需要TET家族成员作为氧化酶来去除DNA胞嘧啶五号碳上的甲基基团。在小鼠中,Tet1在PGC中高度表达,对于种系特异性基因的去甲基化和维持印记是必需的。此外,Tet3大量存在于受精卵中,起到介导小鼠早期胚胎DNA主动去甲基化的作用。然而,牛胚胎中DNA去甲基化是否由TET蛋白催化发生,具体哪一个家族成员在牛早期胚胎发育的去甲基化过程中起主导作用,以及Tet基因和牛胚胎早期发育的相关性等内容一无所知。本研究首先利用荧光定量的方法检测了卵母细胞以及IVF植入前胚胎的Tet家族成员的表达量,结果发现在牛植入前胚胎中只有Tet2和Tet3被检测到。与Tet3的表达量相比,Tet2的表达量相当低,这表明在牛早期胚胎发生重编程的过程中,Tet3起到了主要的作用,而不是Tet1和Tet2。我们采取利用TET酶抑制剂(DMOG)来阻止TET3酶活性的策略,来研究TET3蛋白对牛早期胚胎发育的影响。1mM DMOG的处理明显增加了牛不同发育阶段胚胎的5mC水平。同时,卫星DNA和多能性基因启动子的DNA甲基化水平显着增加。实时PCR分析结果表明Nanog的转录水平在DMOG处理组中显著降低。此外,TET蛋白的抑制会影响囊胚形成,导致囊胚率下降(17.1±1.3%VS 24.1±0.6%),根据TUNEL染色的结果,囊胚阶段内细胞团凋亡的百分比显著增加。另外,凋亡相关基因Bax的表达水平上调,而Bcl-2的表达下调。这些结果支持了TET3蛋白通过影响DNA甲基化重编程、基因表达和细胞凋亡进而在牛早期胚胎发育中起到重要作用。自从第一个克隆动物Dolly诞生以来,体细胞核移植(SCNT)在多种哺乳动物物种中取得了成功。牛作为一种重要的家畜在我国具有重要的经济价值,SCNT技术在牛上得到了长期的应用,效率却一直很低。SCNT低效率的主要原因之一是供体细胞核中DNA甲基化重编程的不完全,导致胚胎发育期间异常的基因表达。我们欲采取在牛胎儿成纤维细胞中过表达Tet3基因,然后利用这种稳定表达的细胞系作为供体细胞进行牛的体细胞核移植的策略,来提高对供体细胞的DNA甲基化重编程,以此来提高牛SCNT效率。本试验最终构建了pHBLV-CMV-Tet3-3flag-EF1-ZsGreen-T2A-Puro过表达载体,并将其转染到牛的胎儿成纤维细胞系中,为进一步检测Tet3基因在过表达细胞中的表达情况,针对与TET3重组成融合蛋白的Flag标签蛋白,我们分别做了免疫荧光和Western检测,结果显示在过表达Tet3的牛成纤维细胞系中检测到了Flag标签蛋白的阳性信号,而在空白组与阴性对照组中,却没有检测到。这表明我们不仅利用慢病毒载体成功将Tet3基因转染牛成纤维细胞中,还使其高效的表达出目的蛋白,这也为下一步提高牛SCNT效率奠定了一定的基础。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S823
【部分图文】：

图 1.经典位点特异性 DNA 维持甲基化模型的示意图持 DNA 甲基转移酶活性被抑制时，导致在一轮复制后产生NA，相当于每个复制周期丧失 50％的甲基化，从而发生 D。相反，DNA 的主动去甲基化并不依赖于 DNA 复制而发生性直接从甲基化碱基去除甲基，或者通过非甲基化碱基来交乳动物中的 DNA 甲基转移酶乳动物中存在 Dnmt1，Dnmt3a 和 Dnmt3b 三种活性的 DNA缺乏催化活性的相关蛋白，称为 Dnmt3L。哺乳动物 DNA 甲部分组成：具有可变大小的具有调控功能的多结构域 N 端部

11图2. 小鼠TET家族蛋白结构示意图2.2.2 TET 酶的底物选择性TET酶的底物优先性可以在三个不同的水平上观察。首先，在CpG环境中主要检测到5mC，但在非CpG环境中也观察到5mC ，并且TET可能优先于另一个环境。体外分析表明，人类TET2对5mCpC和5mCpA的活性低于对5mCpG的活性，可能是受到碱基堆积作用的阻碍[57]。因此，TET在CpG上下游环境中可能优先选择5mC。其次，5mC

半定量 PCR 检测卵母细胞 MII 时期 TET 基因家族的相对 The expression of TET protein transcripts in bovine oocytedetected by Semi-quantitative PCRF 植入前胚胎 TET 基因家族的相对表达量CR 的结果表明， Tet3 在牛早期 IVF 胚胎中具有较高的 m囊胚阶段表达量相对较低。Tet1 和 Tet2 在牛 MII 期卵母始终处于低表达水平(图 1.2)。

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本文编号：2831586