高寒地区低温青贮优良乳酸菌的筛选及低温青贮体系的优化

发布时间：2020-09-30 21:01

　　青藏高原海拔高,大部分地区年平均气温低于0℃,属于高寒地区。当地自然低温青贮存在发酵不充分和易于腐败的难题,而针对低温青贮发酵机理的研究报道却较为少见。为了提高青藏高原当地的青贮饲料品质,建立适合高寒地区的低温青贮技术体系,本文主要进行了以下五部分研究:(1)为了筛选适合低温青贮发酵的优良起时乳酸菌,从青海的大部分地区和西藏的拉萨等典型地区采集80个冰草样品,从中分离出112株乳酸菌代表株,通过16S rRNA基因序列分析,结合形态学特征和生理生化特性,将其鉴定到种或亚种水平。青藏高原本土冰草中附生乳酸菌资源十分丰富,其中39.13%为肠膜明串珠菌属,21.74%为乳球菌属,17.39%为肠球菌属,其余少量为魏斯氏菌属、肉食杆菌属和片球菌属等。对乳酸菌代表株进行了耐盐、耐酸碱、耐高低温胁迫生长实验,以及抑菌活性检测,筛选出广谱抑菌活性的乳酸菌三株。其中QZ311(Pediococcus cellicola)和QZ1137(Leuconostoc mesenteroides)两株代表株在3.0%和6.5%盐浓度中能够存活,在试验条件5°C和10°C低温、45°C和50°C高温环境中生长良好,在pH 3.5-p H 9酸碱环境中能够生长,并能产生广谱抑菌素,对藤黄微球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠道沙门氏菌、单增李斯特菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌均有不同程度的抑制作用。(2)考虑到青藏高原环境恶劣和交通不便等问题,本研究分别采取乳熟期、蜡熟期、全熟期、全熟期收割后暴露3天和暴露10天的玉米秸秆样品进行青贮预实验,探究不同收获期的秸秆青贮中的微生物概况、发酵品质和体外瘤胃消化水平,以期为青藏高原实地取材提供参考。原材料中分离出13株乳酸菌代表株,经鉴定归为5个簇:柠檬明串珠菌(23.1%),类肠膜魏斯氏菌(15.4%),格氏乳球菌(23.1%),粪肠球菌(7.7%)和类植物乳杆菌(30.8%)。原材料收获期为乳熟期、蜡熟期、全熟期、全熟期收割后暴露3天和10天所制作的青贮饲料中乳酸菌含量分别约为8、6、10、3.5和10 log CFU/g,不同成熟期的青贮饲料中优势乳酸菌也不同,其中格氏乳球菌和类植物乳杆菌最为常见。源自不同成熟期材料的青贮饲料中,均检出大肠杆菌、好氧细菌、霉菌和酵母菌等病原菌。对青贮饲料的pH、氨态氮和化学成分进行测定分析,其不同成熟期的青贮饲料中蛋白质含量、粗脂肪含量、干重、酸性洗涤纤维和有机质含量有极显著差别(P0.001),而体外瘤胃发酵24 h后干物质的消化率在P=0.05水平没有显著差别。其中全熟期乳酸菌含量较高,酵母菌和霉菌含量相对较少,干物质和水分含量适中,相对适合作为青贮材料。(3)在青贮早期阶段,乳酸菌可作为添加剂以增加发酵的活性并促进发酵的进行。本研究设想,常温发酵条件与低温发酵条件相比,乳酸菌的最适接种剂量可能有所不同。为优化青藏高原实地青贮的接种剂量,本研究在实验室规模,探索了常温(15-38°C)和低温(4°C)条件下,不同接种剂量(0,6.52,7.52和8.52 log CFU/g FM)对燕麦(Avena sativa L.cv.Qinghai)和小麦(Triticum aestivum L.cv.Qinghai)青贮发酵品质的影响。结果表明,在室温条件下,增加乳酸菌的接种剂量很少或者不能提高青贮品质;低温发酵条件下,增加乳酸菌的接种剂量可以显著提高青贮品质(P0.05),乳酸菌的接种剂量更大时,pH和氨态氮含量更低,乳酸菌的数量和乳酸含量增加,大肠杆菌被有效抑制。在本研究中,收获的新鲜燕麦作物水分含量高达86.55%,不经过萎蔫处理不能用于室温青贮,但可以用作低温青贮材料。分离自青藏高原小麦根部的植物乳杆菌QZ227(Lactobacillus plantaru)与商业菌株FG1相比,在室温发酵条件对酵母菌有更好的抑制作用,在低温发酵条件对大肠杆菌有更优的抑制作用。本研究是第一次探索接种剂量对低温青贮品质的影响,为低温青贮技术提供了依据。(4)本研究将分离自青藏高原的六株耐低温、耐酸且产酸能力好的乳酸菌代表株应用于恒低温燕麦青贮,分析其营养成分变化趋势,以及乳酸菌和主要病原菌的动态变化规律,为高寒地区的自然低温青贮提供参考。六株代表株分别为:酒窖片球菌QZ311(Pediococcus cellicola)和肠膜串珠菌QZ1137(Leuconostoc mesenteroides),植物乳杆菌QZ227(Lactobacillus plantarum),乳酸乳球菌QZ613(Lactococcus lactis),蒙氏肠球菌QZ251(Enterococcus mundtii)和乳酸乳球菌乳酸亚种QZ666(Lactococcus lactis subsp.lactis)。参照青贮成熟期和低温剂量选择的研究结果,将QZ227、QZ251、QZ613和QZ666作为单一添加剂,QZ311和QZ1137作为混合添加剂,以10 log CFU/g FM的接种浓度添加到全熟期燕麦中。在5℃恒低温条件下,QZ227和QZ666处理组在青贮7天时pH已经达到了3.94和3.79的理想水平,在青贮30天时,添加QZ251和QZ613的两组燕麦青贮pH降到3.81和4.12的优良水平,QZ311和QZ1137处理组也降到了4.26。在青贮7天至30天,乳酸菌处理组的大肠杆菌、芽孢杆菌、梭菌、酵母菌和霉菌等常见病原菌得到有效抑制。乳酸菌添加剂对恒低温青贮燕麦的粗蛋白、粗脂肪等营养成分没有显著影响。恒低温青贮条件下,五组乳酸菌添加剂均可快速降低全熟期燕麦pH并有效抑制青贮病原菌,有作为自然低温青贮发酵起始剂的潜质。(5)为建立适宜的自然低温青贮体系,利用以上研究所筛选出的适合低温青贮的优良乳酸菌、选择所确定的最适收获期和低温接种剂量,将分离自极端高寒环境中的五株广谱抑菌特性的乳酸菌代表株用于当地的燕麦和冰草青贮发酵制作。五株乳酸菌代表株分别为植物乳杆菌QZ227,蒙氏肠球菌QZ251,酒窖片球菌QZ311,肠膜明串珠菌QZ1137和乳酸乳球菌QZ613,并以购买的商业菌株植物乳杆菌FG1(Lactobacillus plantarum)作阳性对照,以无菌水作为阴性对照。青贮发酵期间,自然环境的最高温和最低温分别为-22°C和23°C。接种了QZ227和FG1的冰草青贮30天时pH达到了4.15以下的理想水平。冰草青贮30天时对照组和乳酸菌处理组中均有不同数量的病原菌检出,其中QZ227处理组中病原菌含量最少;青贮60天时,只有QZ311和QZ1137处理组中没有检出大肠杆菌,表明自然低温青贮条件,QZ311和QZ1137对大肠杆菌有较好的抑制作用。本研究中所用的添加菌剂均可有效提高燕麦青贮的发酵品质,使其乳酸含量增高,pH降低到理想水平(≤4.17),并能明显抑制青贮中的大肠杆菌、酵母菌和霉菌等病原菌。在整个发酵过程中,QZ227呈现出与商业菌株相当的发酵能力,且在青贮储藏7个月后,其所发酵的青贮饲料腐败率显著低于FG1。腐败青贮饲料中的大肠杆菌,霉菌,梭菌和酵母菌等腐败微生物进行了数量统计并分离保存,进一步测定分析表明,大肠杆菌是主要的产氨态氮病原菌,霉菌和酵母菌的产氨态氮能力则十分有限。本研究以分离自青藏高原的耐低温、耐酸和具有广谱抑菌特性的优良乳酸菌为起时发酵剂,在常温、自然低温和恒低温条件下分析不同青贮材料和不同起时发酵剂的青贮发酵动态变化,以不同成熟期的玉米秸秆青贮动态变化为参考,以低温条件增加乳酸菌的接种剂量显著提高青贮品质为基础,使青贮接种剂量提高到10 log CFU/g FM,将分离自高寒地区的优良乳酸菌用于当地的全熟期燕麦和冰草的青贮发酵制作之中,初步建立了适宜的自然低温青贮体系。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S816.53
【部分图文】：

添加剂,指标,青贮饲料

不仅降低干物质采食量和饲料转化率，还会造成牲畜的瘤胃功能损伤，导致腹泻、乳房炎等病症发生，进而使产奶量降低。2.2 添加剂青贮青贮添加剂始于 60 年代，至今为止，65%以上的青贮饲料会使用添加剂。主要目的是引导发酵过程中乳酸为主的发酵产物的产生。添加剂青贮与自然青贮相比，青贮饲料的有机干重、粗蛋白、天然脂质、纤维素和木质素等化学成分没有显著差别，青贮完成之后的最终乳酸菌数量差别也不大11, 12。研究表明，干物质含量低的青贮原料，可不经萎蔫处理，青贮前混入乳酸菌发酵液添加剂即可有效提高青贮品质13。青贮添加剂显著影响青贮质量，优质的青贮添加剂能够显著提高青贮饲料的品质。研究表明，活的乳酸菌培养液可以减少急性瘤胃酸的发病率14，以添加有 12×107CFU/kg DM 的大麦谷物和大麦饲料饲喂牲畜，可以改善瘤胃发酵15，可能由于乳酸菌饲喂添加剂有助于产生适应乳酸环境的瘤胃菌群。

扩大培养,涂布,抑菌效应,培养基

第二章青藏高原地区冰草中乳酸菌的分离鉴定及抑菌效应分析20 g 切段样品放置于 180 ml 的无菌水中，充分震荡混匀，取液体依次稀释成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5五个梯度，分别从 10-1，10-3，10-5稀释液中吸取 μ/，用涂布棒均匀涂布在 MRS （Lactobacillus agar as described by De Man, Rogosaand Sharpe; Merck, Darmstadt, Germany）固体培养基上，厌氧培养箱中恒温 30℃倒置培养 48 h。对 MRS 培养基上的单菌落统计计数，综合菌落的表征信息如形态、颜色、透明度和大小等对单菌落进行辨别并编号，挑取不同编号的单菌落分别扩大培养，纯化培养两次，用面签将扩大培养的代表株转存于含有 10％二甲基亚砜的营养肉汤培养基（NB，QingDao Hopebio-Technology Co.,Ltd.Qingdao, China），-80℃超低温冰箱存放备用。

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第三章不同成熟期玉米秸秆青贮的微生物概况、发酵品质和体外瘤胃消化水平的研究三章不同成熟期玉米秸秆青贮的微生物概况、发酵品和体外瘤胃消化水平的研究介青藏高原被称为“世界屋脊”，是世界上除两极以外最冷的地区91。宁至西藏拉萨的青藏铁路全长 1956 公里（图 3.1），于 2006 年 7 月，在此之前，青藏高原没有其他更经济快速的交通方式92。青藏高原偏高、天气条件恶劣等极端条件的限制，使得对该地区的任何研究都很。为了确定高寒地区自然青贮所需原材料的适宜取材时间，本研究预同收获期的青贮材料进行先行评估，为青藏高原实地取材提供参考依

【参考文献】