黔北麻羊FTO基因多态性及其表达与肉质性状的关联性研究

发布时间：2020-10-02 07:09

　　 为探索黔北麻羊FTO基因多态性与血清脂代谢相关指标的关联性,以及不同月龄黔北麻羊FTO基因及蛋白的表达情况与肉质性状的相关性,本实验以103只4月龄~2岁左右黔北麻羊为研究对象,采用PCR产物直接测序技术筛选FTO基因SNPs,并与测定的血清脂代谢相关指标进行关联性分析,同时测定4月龄、1.5岁、2.5岁黔北麻羊肉质性状,将测定结果与荧光定量PCR及蛋白免疫印迹技术检测的FTO基因及蛋白表达量相关性分析,得到与血清脂代谢相关指标特别是与脂肪沉积有显著效应的遗传标记,通过比较不同年龄段黔北麻羊FTO基因及其蛋白的表达情况及与肉质性状的相关性,为揭示FTO基因在黔北麻羊上的遗传效应、调控脂肪代谢的分子机制提供参考,同时为黔北麻羊优良肉质性状选育及分子标记数据库的建立提供依据。实验结果如下:1.黔北麻羊FTO基因SNPs的筛选、生物信息学及遗传特异性分析采用DNA直接测序方法在黔北麻羊FTO基因第2、3、9外显子及部分内含子中共发现9个SNPs。生物信息学分析表明,FTO蛋白存在1个低复杂度区域、1个NTD催化结构域、不存在跨膜结构、有7个Ser、5个Thr、5个Tyr可能成为磷酸化位点。第3外显子的4个突变位于FTO蛋白的NTD催化结构域内,其中g.T125417C,g.T125300A位点的变异引起mRNA二级结构的改变。测序结果显示,各突变位点均存在三种基因型,遗传特性分析表明,各突变位点均属于中度多态性(0.25PIC0.5)且均未偏离Hardy-Weinberg平衡状态,能提供合理的遗传信息。单倍型和连锁不平衡分析表明,群体存在22种单倍型,其中有7个发生频率较高,g.T125300A,g.C125357T,g.G125405T,gT125417C 4个位点间r~2值均大于0.33,存在较强的遗传连锁不平衡效应。g.T426229C,g.C426244G,g.G426347A 3个位点间r~2分别为1.000、0.738、0.738,表明也存在较强的遗传连锁不平衡效应。2.FTO基因多态性与血清脂代谢相关指标关联性分析将黔北麻羊FTO基因筛选出的9个SNPs与所测血清脂代谢指标进行关联性分析,共得到3个位点与血清脂代谢指标有关联。其中,4月龄发现有2个位点:g.T125300A位点不同基因型血清ADP及LEP含量差异显著(P0.05),g.G125405T位点不同基因型血清ADP含量差异显著(P0.05)而LEP含量差异极显著(P0.01);2岁左右成年黔北麻羊发现有3个位点:g.T125300A、g.G426347A位点不同基因型血清AST及ALT含量差异极显著(P0.01),g.G125405T位点不同基因型血清AST及ALT含量差异显著(P0.05),血清HSL含量在g.G426347A位点不同基因型间差异显著(P0.05)。将2岁左右成年羊中与血清脂代谢指标有显著关联性的3个位点合并,进行与血清脂代谢指标关联性分析,发现纯合子TTGGGG为调控黔北麻羊脂肪沉积的优势组合基因型。3.黔北麻羊肉质性状研究根据黔北麻羊生长发育特点,结合当前国内外肥羔生产特点及当地屠宰习惯,选择4月龄、1.5岁、2.5岁黔北麻羊进行肉质性状测定。结果表明,肌内粗脂肪、粗蛋白含量、熟肉率、剪切力及失水率均随年龄增加而升高,肌内粗脂肪含量在3个年龄段间均差异极显著(P0.01),2.5岁黔北麻羊粗蛋白含量与1.5岁、4月龄差异极显著(P0.01)。综合所测定的各肉质指标,2.5岁黔北麻羊的粗脂肪和粗蛋白含量较1.5岁和4月龄高。4.黔北麻羊FTO基因及重要组织蛋白表达与肉质性状相关性分析应用实时荧光定量PCR检测FTO基因在4月龄、1.5岁及2.5岁黔北麻羊心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胸腺、腹部脂肪、下丘脑及背最长肌组织中的表达差异,发现FTO基因在不同月龄黔北麻羊不同组织中具有差异性。其中,4月龄黔北麻羊FTO mRNA的表达为下丘脑肝脏腹部脂肪心脏肾脏肺脾脏胸腺背最长肌;1.5岁黔北麻羊FTO mRNA的表达为肝脏脾脏胸腺下丘脑腹部脂肪肾脏肺心脏背最长肌;2.5岁黔北麻羊FTO mRNA的表达为脾脏胸腺下丘脑腹部脂肪肝脏肾脏心脏肺背最长肌。同时选择与机体脂肪合成、储存、分解及沉积最重要的三个组织(肝脏、背最长肌及腹部脂肪),应用Werstern blot检测其FTO蛋白表达,结果表明,4月龄黔北麻羊FTO蛋白肝脏腹部脂肪背最长肌,1.5岁腹部脂肪肝脏背最长肌;2.5岁肝脏腹部脂肪背最长肌。与肉质性状相关性分析表明,不同部位FTO mRNA及蛋白表达量与肉质性状的相关性在不同月龄间存在差异,总体趋势表现为:4月龄及1.5岁FTO mRNA及蛋白表达量与肉质指标的相关性比2.5岁强。
【学位单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S827.2
【部分图文】：

贵州大学 2019 届硕士研究生学位论文游基因、蛋白表达水平（Bartosovic 等，2017；刘鑫骨骼肌细胞中脂质积累分子机制进行研究，发现 m含量呈负相关，并且受 AMPK 调控。增加 mRNAm肪细胞 3T3-L1 分化，而降低 mRNA m6A 甲基化水 FTO 负调节 mRNAm6A 甲基化水平。mRNAm6A相关基因（C/EBPα和 FAS）以及脂解和氧化相关基的表达来抑制骨骼肌脂质积累。进一步研究发现 FT能影响骨骼肌细胞中的 m6A 甲基化和细胞脂质积 AMPK-FTO-mRNAm6A 甲基化途径来控制骨骼肌治疗肥胖、2 型糖尿病提供新思路（图 1-1）。

贵州大学 2019 届硕士研究生学位论文位 SNPs 位点连锁不平衡分析采用在线 SHEsis 软件（赵宪林等，2018）结果与分析黔北麻羊基因组 DNA 检测结果提取的 DNA 样本与 Loading Buffer 混合均匀点样至 1.2%琼脂糖凝胶进电压 120 V 电泳 25 min，结果如图 2-1。由图可知，实验所提取的黔北A 样本条带明亮单一，且无杂带，说明所提取 DNA 完整性比较好。所 样经分光光度计检测，结果显示，所提 DNA 样品 OD260/280 值均在 1.6-说明所提取 DNA 样本浓度和纯度均属于正常范围，可用于后续实验。

g.G426347A3 个位点间 r2分别为 1.000、0.738、0.738，表明也存在较强的遗传连锁不平衡效应（表 2-4）（图2-4）。位点 样本 基因型(基因型频率) 等位基因 遗传杂合度 有效等位基因 PIC χ2g.C109453T 103 TT(0.36);CT(0.45);CC(0.19) T(0.61);C(0.39) 0.42 1.91 0.36 2.70g.G109518T 103 GG(0.16);GA(0.46);AA(0.38) A(0.65);G(0.35) 0.47 1.84 0.35 3.71g.T125300A 103 TT(0.51);AT(0.42);AA(0.07) T(0.67);A(0.33) 0.41 1.78 0.34 3.06g.C125357T 103 TT(0.05);TC(0.44);CC(0.51) T(0.31);A(0.69) 0.43 1.74 0.33 4.62g.G125405T 103 TG(0.43);GG(0.51);TT(0.06) T(0.32);G(0.68) 0.51 1.76 0.34 3.77g.T125417C 103 CC(0.07);TC(0.42);TT(0.51) T(0.28);C(0.72) 0.40 1.67 0.32 3.06g.T426229C 103 CC(0.29);TC(0.48);TT(0.23) T(0.48);C(0.52) 0.49 1.95 0.37 1.02g.C426244G 103 CC(0.25);GC(0.50);GG(0.25) C(0.50);G(0.50） 0.50 1.99 0.38 1.92g.G426347A 103 TT(0.28);TC(0.50);CC(0.22) T(0.52);C(0.48) 0.50 1.99 0.37 1.02

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