鸭疫里默氏杆菌四环素耐药基因M949_RS06330单克隆抗体的制备及调控研究

发布时间：2020-10-09 07:35

　　近年来,由于抗生素的滥用,导致鸭疫里默氏杆菌的四环素耐药株逐渐增多,而目前对于鸭疫里默氏杆菌四环素耐药性的研究多偏向于药敏实验或流行性分析,对鸭疫里默氏杆菌四环素耐药基因和耐药机制鲜有报道。通过比较基因组及生物信息学分析发现鸭疫里默氏杆菌血清1型野生株CH3基因组中含有一个编码RND家族外排泵基因M949_RS06330,其上游序列存在一个四环素阻遏蛋白Tet R蛋白(M949_RS06320)以及I型分泌系统TolC家族蛋白(M949_RS06325)。因此推断这三个基因组成了一个与四环素耐药相关的功能区。本研究利用生物信息学软件对M949_RS06330进行了基因分析及相关调控研究;借助大肠杆菌原核表达系统及单克隆抗体技术,对M949_RS06330进行了原核表达并制备了其单克隆抗体;以四环素类药物中的四环素及替加环素为代表,通过荧光定量PCR及Western Blot技术,探究了四环素类药物对M949_RS06330以及M949_RS06320、M949_RS06325基因表达的影响。1.M949_RS06330的生物信息学分析检索GenBank数据库中已公布的鸭疫里默氏杆菌基因组序列,进行M949_RS06330同源蛋白多重序列比对和进化树分析。结果表明,M949_RS06330与黄杆菌(Flavobacteriaceae bacterium)、金黄杆菌(Chryseobacterium)等同源蛋白亲缘关系较近,与鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium mizutaii)、乳酸乳杆菌(Sphingobacterium lactis)等同源蛋白亲缘关系较远;现有公开发表的31株鸭疫里默氏杆菌全基因组序列中,仅在2型(RA-CH-2、RA Yb2、RA-GD、RA DSM 15868、RA-YM)及1型(RA-CH-1、CH3)鸭疫里默氏杆菌基因组中比对到M949_RS06330同源蛋白;针对本实验室从全国各地规模化鸭场收集的鸭疫里默氏杆菌进行M949_RS06330同源基因调查,发现有16株具有该基因,经测序比对和进化树分析发现,M949_RS06330在2型及15型血清型的菌株中有较好的保守性,但在血清1型中差别较为明显,可分为两支。综合以上分析,可以推断M949_RS06330可能并不是鸭疫里默氏杆菌固有结构基因,而是在长期进化过程中所获得的外源基因。2.M949_RS06330的原核表达及其单克隆抗体的制备将基因M949_RS06330全长序列插入pET28a载体中,构建pET28a-M949_RS06330重组质粒,并转化到感受态宿主菌BL21(DE3)中,加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)37℃小量诱导表达6h,进行SDS-PAGE检测,结果获得预期大小的M949_RS06330重组蛋白。将M949_RS06330重组蛋白大量表达,SDS-PAGE分析结果显示,蛋白主要表达在上清。上清蛋白纯化后,作为免疫原等体积包裹弗氏完全佐剂,注射8周龄BALB/C小鼠,经过三次免疫和效价检测,选取效价最高的小鼠超免,超免后取该小鼠的脾细胞与SP2/0杂交瘤细胞融合。三次亚克隆后筛选出一株分泌特异性抗体的单克隆细胞株1E11。然后制备腹水以大量生产该单克隆抗体。1E11单抗亚型鉴定表明该单克隆抗体轻链为k,重链为IgG2b;ELISA检测该单抗效价达到1:2048000;Western blot检测该单抗特异性,结果显示该单抗特异性良好。3.四环素类药物对M949_RS06330调控作用研究在培养基中分别添加0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL的替加环素和四环素,以不加任何药物的CH3菌液作为空白对照。设计M949_RS06320、M949_RS06325和M949_RS06330的q-RT PCR特异性引物,以鸭疫里默氏杆菌16srRNA为内参基因,采用荧光定量PCR方法检测不同浓度梯度的替加环素和四环素对M949_RS06320、M949_RS06325和M949_RS06330 mRNA表达的影响。按照2~((-ΔΔCt))相对定量PCR法计算分析结果,用GraphPad Prism 5软件作图。结果表明:替加环素、四环素对这三种基因mRNA水平呈现明显诱导作用;利用制备的M949_RS06330单抗,Western blot检测不同浓度的替加环素和四环素对M949_RS06330蛋白表达的影响,结果表明替加环素和四环素对M949_RS06330蛋白有明显诱导作用,与荧光定量PCR结果一致。
【学位单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.61
【部分图文】：

产物,方法,反应液,载体

Fig.1-1 The method of PCR product gel recovery1.2.2.6 pET28a-M949_RS06330 原核表达载体的构建使用 BamH I 和 EcoR I 两种限制性内切酶按如下体系分别酶切目的基因和pET28a 载体。37℃恒温水浴酶切 3h。反应液组分体积BamH I 1μLEcoR I 1μL10×K buffer 2μLpET28a 载体 6μLddH2O 10μLTotal 20μL反应液组分体积BamH I 1μLEcoR I 1μL10×K buffer 2μL目的基因 8μLddH2O 8μLTotal 20μL图 1-1 PCR 产物胶回收方法

提取方法,重组质粒,菌液

14Fig.1-2 Extraction of recombinant plasmids1.2.2.10 重组蛋白的原核表达将构建并测序正确的重组质粒用化学转化法转化入大肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞中，挑取单菌落至卡那霉素抗性的 LB 培养基中培养，参照 1.2.2.7 的方法进行 PCR 鉴定。（1）将鉴定成功的含有重组质粒的菌液和含有pET28a空载的菌液分别接种于卡那抗性 LB 中过夜培养（2）将摇好的菌液以 1:100 的比例加到卡那抗性 LB 中，37℃恒温振摇培养至OD600≈0.6-0.8（3）以 1:1000 的比例加入 IPTG，37℃恒温振摇 6h（4）将菌体于 4℃，10000rpm 离心 3min，弃上清图 1-2 重组质粒小量提取方法

蛋白信号,氨基酸

2 结果2.1 M949_RS06330 基因序列的生物信息学分析鸭疫里默氏杆菌野生株 CH3 的 M949_RS06330 基因编码区全长 1056bp，编码351 个氨基酸，理论分子量为 36909.58，等电点 9.41，带正电荷的氨基酸总数为 38个，带负电荷的氨基酸总数为 29 个。信号肽分析显示 RS06330 编码蛋白没有信号肽,如图 2-1。

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