马鹿Ghrelin cDNA全长序列的克隆及其在各器官内表达的研究

发布时间：2020-10-09 05:20

　　 Ghrelin是一种首先在胃部发现的、与生长激素促分泌素受体(Growth hormone secretagogue receptor,GHS-R)结合后发挥其功能性作用的激素。大量研究表明Ghrelin具有调控生长激素(Growth hormone,GH)、刺激食欲和调节能量平衡、影响胰岛素分泌和调节糖代谢、抗炎免疫、增强心脏功能和保护消化道黏膜等多种生物学效应。马鹿是一种珍贵的反刍动物,目前极少有关于马鹿Ghrelin的研究报道。本研究为探知马鹿Ghrelin cDNA全长序列及Ghrelin在马鹿体内可能表达的器官,利用克隆、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和生物信息学分析等技术对其进行研究。结果显示:首次获得马鹿Ghrelin cDNA全长序列,共539 bp,包含46 bp的5′非翻译区(5′Untranslated Region,5′UTR)、351 bp开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)及128 bp的3′非翻译区(3′UTR)。该ORF编码116个氨基酸残基,包括23个氨基酸残基组成的信号肽,27个氨基酸残基组成的成熟肽及66个氨基酸残基组成的C-末端肽。生物信息学分析显示:马鹿Ghrelin基因编码产物存在跨膜区域和信号肽。RT-PCR和RT-qPCR结果显示:Ghrelin mRNA在马鹿的舌、食管、瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、大脑、下丘脑、气管黏膜、肺、心肌、心内膜、肝、胰、脾、肾、输尿管、膀胱、输卵管、子宫、阴道、垂体、松果体、颌下腺、腮腺、甲状腺、淋巴结、肾上腺、卵巢和骨骼肌等器官中均有表达,且皱胃内的表达量明显高于其它器官。以上研究结果为进一步探究Ghrelin基因的相关生物信息学情况奠定理论基础,同时为研究Ghrelin在马鹿体内的生理功能提供有效依据。
【学位单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S825
【部分图文】：

电泳图,中间片,产物,电泳

3.1.1 马鹿 Ghrelin cDNA 中间片段、3′RACE 和 5′RACE 扩增结果经1%的琼脂凝胶电泳检测，马鹿Ghrelin cDNA中间片段产物约为165 bp，3′RACE产物约为212 bp，5′RACE产物约为364 bp，均与预期片段大小相同（图1）。SYBR Premin Ex TaqII（2×）P3 primer/ P5 primer（10 μmol/L）P4 primer/ P6 primer（10 μmol/L）cDNAddH2OTotal100.80.826.420图 1 中间片段（M1）、3′RACE（M2）和 5′RACE（M3）产物的电泳结果Fig. 1 Electrophoresis analysis of intermediate segment (M1), 3' RACE (M2) and 5' RACE (M3) product.Marker. DL2000 DNAMarker

电泳图,菌液,PCR鉴定,电泳

与3′RACE和5′RACE扩增的片段大小相同，证明载体与目的片段连接成功（图2）。图 2 菌液 PCR 鉴定 3′RACE 和 5′RACE 产物的电泳结果Fig. 2 Electrophoresis analysis of 3' RACE and 5' RACE product.Marker. DL2000 DNAMarker3.1.3 马鹿 Ghrelin 全长 cDNA 序列分析将 PCR 鉴定正确的阳性菌液送北京美吉生物医药科技有限公司测定。马鹿Ghrelin cDNA 的序列全长 539 bp，这一序列包含 46 bp 的 5′UTR、351 bp 的 ORF 和128 bp 的 3′UTR，编码 116 个氨基酸，起始与终止密码子分别为 ATG 和 TGA（图 3）。

氨基酸序列,马鹿,氨基酸序列,序列

ATG: 起始密码子、*终止密码子、预测的信号肽、成熟肽和 c-末端肽分别用下划线、阴影和虚线表示ATG is start codon, * is stop codon, signal peptide is underlined, the activation peptide is shaded and dashedline is used for c-terminal peptide.图 3 马鹿 Ghrelin cDNA 的序列和预测的氨基酸序列Fig. 3 The cDNA sequence and amino acid sequence of Ghrelin gene in red deer3.1.4 马鹿 Ghrelin cDNA 全序列的同源性比较使用 MegAlign 软件将马鹿 Ghrelin cDNA 和其他物种进行同源性分析。结果显示，马鹿 Ghrelin cDNA 与驯鹿、梅花鹿、山羊、绵羊、牛的同源性最高为 98.3%、98.1%、94.1%、92.7%、91.4%，其次是恒河猴、猪、狗、人分别为 76.3%、69.7%、69.0%、66.1%，而与野鸽、鸡和草鱼同源性最低分别为 36.5%、36.4%和 25.1%（图4）。上述各物种 Ghrelin 基因的生物进化树分析显示，马鹿与驯鹿、梅花鹿、山羊、绵羊和牛在生物进化树中距离最近（图 5）。

【参考文献】