重组H9N2亚型禽流感病毒冷适应和NS截短致弱活疫苗的研制

发布时间：2020-10-09 08:24

　　禽流感(Avian influenza,AI)是严重危害我国养鸡业健康发展和人类健康的一种重要疫病,其中H9N2亚型禽流感在我国呈地方流行性,具有经济和公共卫生意义。现有的H9N2亚型禽流感疫苗主要采用流行毒株研制成的油乳灭活苗,但这类灭活疫苗抗原谱窄,不能诱导细胞免疫和黏膜免疫,难以应对禽流感病毒抗原的快速变异。近些年的一些研究发现,部分已进行疫苗接种的养殖场依然经常暴发H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的感染。之后的研究进一步证实,该现象是由于H9N2亚型AIV不断地发生变异而导致抗原性发生改变所引起的,因此有必要对H9N2亚型AIV的疫苗株进行更新并开展新型疫苗的研制。本研究以实验室培育的一株H9N2亚型AIV冷适应株TX-25-CE30为骨架,通过拯救条件的摸索,将其HA、NA基因替换为母本株TX的对应片段,构建了“6+2”模式的冷适应致弱重组毒株,另外,将其NS基因替换为NS1基因缺失的片段,构建了冷适应联合NS1基因缺失的双重致弱毒株,评价了构建毒株的生物学特性,并对其免疫效力进行了评价,为禽流感疫苗的研制提供了新的思路。1 H9N2亚型禽流感病毒冷适应株的冷适应、温度敏感表型相关基因鉴定为了鉴定实验室所培育的H9N2亚型AIV冷适应毒株与冷适应特性、温度敏感性相关的关键基因,利用PR8骨架,将冷适应毒株TX-25-CE30各基因的表达质粒逐一替换PR8的相应基因,转染293T和MDCK共培养细胞,共获得8个重组病毒。对重组病毒进行的冷适应特性、温度敏感性鉴定试验表明NP基因对冷适应特性起最关键作用,NA基因对冷适应特性有一定作用。PB2、NP基因对温度敏感性起最关键作用,PB1、M基因对温度敏感性有一定作用。以TX为骨架,将其NP基因替换为冷适应株NP基因,拯救得到重组毒rTX-25-NP,同时将其NS基因替换为NS1基因缺失程度不同的片段得到重组毒rTX-25-NP-NS1-73、rTX-25-NP-NS1-128,这些带有冷适应株 TX-25-CE30 的 NP 基因的重组毒,没有获得明显的冷适应特性及温度敏感性。因此,冷适应株TX-25-CE30的冷适应特性及温度敏感性是多个内部基因的协同作用。2 H9N2亚型禽流感病毒冷适应株拯救条件的探索测定冷适应株TX-25-CE30在不同细胞上的复制能力,结果表明其在常见的拯救流感病毒用细胞293T、MDCK、Vero、COS-1上的复制均较差,在鸡胚成纤维细胞上的复制能力较好,在可传代的鸡成纤维细胞系DF-1上也有一定的复制能力。TX-25-CE30在33℃,2μg/mL TPCK胰酶浓度条件下在293T、DF-1上的复制能力最佳。在33℃条件下,冷适应株在鸡胚中复制滴度最高。将表达H9N2亚型冷适应减毒株TX-25-CE30基因的8个质粒,按照优化条件共转染293T和DF-1共培养细胞,成功获得重组毒株rTX-25-CE3Q,该病毒与母本毒株一样,具有冷适应特性及温度敏感性。3冷适应和NS截短致弱的重组H9N2亚型禽流感病毒的构建及免疫效力评价以冷适应株TX-25-CE30内部基因为骨架,通过第二章建立的反向遗传平台,成功拯救出HA、NA基因替换为TX株的重组毒株,命名为rTXca-HA-NA;成功拯救出冷适应联合NS1基因缺失的双重致弱重组毒,其HA、NA基因来源于母本株TX,NS基因为NS1N端保留73位氨基酸的缺失片段,其余内部基因来自冷适应株TX-25-CE30,命名为rTXca HA-NA-NS73。rTXca-HA-NA-NS73免疫鸡后,无法在气管和肺组织中检测到病毒。rTXca-HA-NA仅有1只鸡可以在感染病毒后第5天在肺组织中检测到,其余鸡无法在气管和肺中检测到病毒。rTX-NS1-73可以在鸡气管检测到低水平复制滴度;在肺组织中,只有接种后第3天在1只鸡检测到低水平复制滴度,其余鸡没有在肺中检测到病毒。重组母本毒rTX在气管和肺中检测到的复制滴度最高。rTXca-HA-NA、rTXca-HA-NA-NS73 2种病毒接种组鸡可以通过喉头排毒,但几乎不能通过泄殖腔排毒,且这两种病毒均丧失了接触传播能力。rTX-NS1-73组鸡可以通过喉头排毒,但不能通过泄殖腔排毒。rTX-NS1-73并未丧失接触传播能力,接触鸡可在接触后第3、5天通过喉头排毒,但不能通过泄殖腔排毒,在接触后21天,接触鸡均出现了血清阳转的现象。重组母本毒rTX接种鸡可以通过喉头、泄殖腔排毒。rTX存在接触传播能力,接触鸡可通过喉头、泄殖腔排毒。3种致弱毒株rTX-NS1-73、rTX ca-HA-NA、rTX ca-HA-NA-NS73在免疫鸡后均可诱导鸡产生较高的HI抗体水平。以母本毒rTX攻毒,rTX ca-HA-NA提供了 100%的排毒保护,rTX ca-HA-NA-NS73提供了 90%的喉头排毒保护;100%泄殖腔排毒保护;rTX-NS1-73提供了 100%喉头排毒保护及75%泄殖腔排毒保护。以抗原差异较大的YZ-C进行攻毒,rTXca-HA-NA、rTXca-HA-NA-NS73、rTX-NS1-73不能有效阻止病毒通过喉头排出,但可以显著减少泄殖腔排毒。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S858.31
【部分图文】：

复合体结构,核糖核蛋白,流感病毒

一步细分为不同的亚型。季节性流感流行是由Ａ型流感和Ｂ型流感病毒引起的，而Ａ型逡逑流感病毒则是造成流感大流行的主要病原。流感病毒是有囊膜的负链分节段ＲＮＡ病毒，逡逑具有两种表面糖蛋白基因和六种内部蛋白基因（图１－１）。表面糖蛋白ＨＡ和ＮＡ使病毒能逡逑够结合、进入和脱离被感染细胞。ＨＡ三聚体蛋白具有球状头部区域，其具有唾液酸受体逡逑结合位点，使病毒能够附着于宿主细胞。球状头部上这些受体结合位点的突变导致其结合逡逑能力的改变；而抗原表位的变异产生了导致季节性流感暴发的抗原漂移的病毒株。在不可逡逑预测的时间段，不同亚型Ａ型流感病毒可经历基因重配以产生新的病毒株，其能够在未免逡逑疫的群体中引起流感大流行。一旦引起大流行的流感病毒株出现，它通常取代先前流行的逡逑相同亚型的Ａ型流感病毒株，如２００９邋ＨｌＮｌｐｄｍ０９病毒。此外，人类与Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９或逡逑Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒感染的家禽密切接触后可引起感染，但禽流感病毒迄今仍未获得在逡逑人类之间接触传播的能力［１］。逡逑目前，疫苗接种仍是预防流感最有效的途径，流感疫苗主要有灭活疫苗和减毒活疫苗。逡逑灭活疫苗的使用有长达５０余年历史

流感疫苗,疫苗

缩短疫苗制造时间，研发针对流感病毒有效的通用疫苗，并开展疫苗储备。逡逑每年针对目标群体批准推荐的流感疫苗有灭活疫苗，或者近年来研制的减毒活疫苗。逡逑目前较为新颖的疫苗有ＤＮＡ疫苗及合成肽疫苗（图１－２）。灭活疫苗包括病毒裂解疫苗和逡逑全病毒灭活苗。根据血凝素的量使疫苗标准化，通常每种毒株的量为１５邋的ＨＡ，用于逡逑老年人的高剂量疫苗最近也获得了许可，每种毒株的量为６０邋ｐｇ邋ＨＡＷ。水包油类的佐剂可逡逑以增加疫苗的免疫原性，同时可以节约流行病毒疫苗的用量％。灭活疫苗具有极佳的安全逡逑性，６月龄以上的儿童、老年人，哮喘病患者和其他高危人群均建议使用。逡逑Ｗ逡逑逦邋＃邋■邋＂邋逦逡逑ＤＮＡ逦ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ邋ｐｅｐｔｉｄｅｓ逦ｓｕｂｕｎｉｔ逡逑］ｉｎ，Ｕｅｎｚａ邋ｖｉｒｕｓ逦ｆ＼逡逑邮逦％？汐逡逑ｓｐｌｉｔ邋ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ邋ｖｉｒｕｓ逦ｖｉｒｉｏｎ邋ｌｉｋｅ邋ｐａｒｔｉｃｌｅｓ逡逑r>曑，逡逑ｗｈｏｌｅ邋ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ邋ｖｉｒｕｓ逦ｌｉｖｅ邋ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ逦ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ邋ｖｉｒｕｓ逡逑ｉｎｆｌｕｅｎｚａ邋ｖｉｒｕｓ邋（ＬＡＩＶ）逡逑图１－２流感疫苗的不同组成（引自ＳａｒａｎｙａＳｒｉｄｈａｒ，２０１５）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ｉｎ

病毒复制,流感疫苗,树突细胞,减毒

流感病毒的最适培养温度为３３°Ｃ，在较高的温度（２３８°Ｃ）病毒复制将受到抑制，病毒不逡逑能进行增殖。因此当人感染病毒后，该病毒仅能在上呼吸道复制，诱导机体产生黏膜免疫、逡逑体液免疫及细胞免疫等保护作用（图１－４），却不能在下呼吸道（一般发烧的病人其下呼吸逡逑道的温度为３８？４０°Ｃ）复制，这样就不会引起肺部感染等并发症，表现出良好的安全性及逡逑有效性［１３］。逡逑在接下来的２５年中，减毒的Ａ／Ｈｌ，Ａ／Ｈ３和Ｂ型分离株在成人和儿童中进行了详逡逑细研宄，各项研宄结果证明它们单独或合并成三价候选疫苗时具有良好的耐受性、免疫原逡逑性和有效性。１９９５邋年，Ａｖｉｒｏｎ邋（现为邋Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ邋Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，邋Ｍａｒｙｌａｎｄ）与国逡逑家过敏和传染病研究所合作，并通过与密歇根大学签订的许可协议，获得了开发ＬＡＩＶ的逡逑权利［１４］。在１９９７－１９９８流感季节，对＞邋３０００名儿童进行了双盲，安慰剂对照研宄／ＬＡＩＶ逡逑对流感感染的保护率＞邋９０％［１５］。Ａｖｉｒｏｎ于２０００年向美国食品药品管理局申请执照，并于逡逑２００３年批准ＬＡＩＶ上市用于５至４９岁的儿童和成人。为了获得产品批准

【相似文献】