延黄牛ALDH1A1基因对脂代谢的影响及其遗传变异分析

发布时间：2020-10-09 10:29

　　 ALDH1A1为乙醛脱氢酶(ALDH)基因超家族成员之一,是参与视黄醛代谢、促进维甲酸代谢通路的活化和调控脂肪酸代谢通路的关键基因之一。本试验将ALDH1A1基因构建到PMD18-T载体上,克隆延黄牛ALDH1A1基因cDNA序列,利用生物信息学软件分析该基因理化性质及其蛋白结构,并通过qRT-PCR技术检测ALDH1A1基因在延黄牛各个组织间的表达差异。结果显示:延黄牛ALDH1A1基因共编码501个氨基酸,理论等电点为7.16,属于碱性氨基酸,在细胞质中发挥主要作用;不是分泌性蛋白,属于亲水性蛋白,存在31个氨基酸磷酸化位点;蛋白质二级和三级结构预测结果显示4种结构,分别是α螺旋、β折叠、β转角和无规则卷曲。ALDH1A1基因在肝、胃、皮下脂肪、十二指肠和肾组织中表达极显著(P0.01),在背最长肌中显著表达(P0.05)。利用分子克隆技术成功构建了延黄牛ALDH1A1基因的siRNA干扰和过表达载体,再由脂质体2000介导转染到体外分离的延黄牛前体脂肪细胞中,利用qRT-PCR和蛋白质免疫印记检测ALDH 1A1基因mRN A和蛋白水平的表达情况。结果显示:ALDH1A1、LPL和成脂关键基因(C/EBPα和PPARγ),在诱导延黄牛前体脂肪细胞分化时呈现先升高后降低的趋势。ALDH1A1基因干扰组在诱导前体脂肪细胞分化的第0、4和9天中,呈现出先下降后升高的趋势;而过表达组在诱导前体脂肪细胞分化的第0、4和9天中,呈现出先升高后下降的趋势;ALDH1A1基因的过表达能显著促进成熟脂肪细胞脂滴和甘油三酯的生成,同时还显著促进LPL和成脂关键因子C/EBPα和PPARγ的表达,而ALDH1A1基因的干扰则与其相反,显著降低脂肪细胞脂滴及甘油三酯含量的生成,且显著抑制LPL和成脂关键因子C/EBPα和PPARγ的表达。研究表明ALDH1A1基因参与前体脂肪细胞分化的过程。为了进一步探索ALDH1A1基因的功能,本研究以99头18月龄的延黄牛母牛为试验对象,通过测序的方法筛查ALDH1A1基因的多态位点,再分析其与延黄牛肉用性状的关联性。结果显示:延黄牛ALDH1A1基因13个外显子中只有外显子4和11中检测到突变位点。外显子4在Chr9.49381142处存在T/G的突变且引起编码氨雄酸络氨酸的改变。外显子11在Chr9.49361243处存在T/A的突变,未引起编码氨基酸发生改变。内含子4在Chr9.49381356处存在G/T的突变。关联分析结果显示:ALDH1A1基因外显子4 TT基因型与延黄牛肉用性状中的十字部高、胸围、腹围、管围和背膘厚存在显著相关(P0.05),与肌内脂肪具有一定的相关性(P0.056);ALDH1A1基因外显子11 AA基因型与延黄牛肉用性状中的十字部高、官围、体重和背膘厚存在显著相关(P0.05)。综上所述,本研究成功克隆获得延黄牛ALDH1A1基因编码区序列,并研究该基因在延黄牛各组织间的表达差异以及对脂代谢的影响和遗传多态性分析,为开展延黄牛ALDH1A1基因的功能及肉质基因筛选的工作提供理论基础和科学依据。
【学位单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S823.81
【部分图文】：

长肌,皮下脂肪,琼脂糖凝胶电泳,条带

２．３．邋１总ＲＮＡ电泳检测结果逡逑对各组织总ＲＮＡ进行琼脂糖凝胶电泳并在凝胶成像仪下观察，提取的ＲＮＡ逡逑完整性较好（见图２．１），其Ｄ２６Ｇｎｎｉ／Ｄ２８（）ｎｍ值均在２．０左右，说明ＲＮＡ提取质量逡逑较高，可用于后续试验。逡逑１逦２逦３逦４逦５逦６逦７逦８逡逑—Ｉ、逡逑图２．邋１邋ＫＮＡ琼脂糖凝胶电泳图逡逑注；１，２，邋３，邋４，邋５，６，，７，邋８分别表乐心、肝、肺、贤、捋、ｆ邋：指肠、皮下脂肪和竹eA长肌。逡逑Ｆｉｇ．邋２．邋１邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ＲＮＡ逡逑Ｎｏｔｅ；邋１，２，３，４．５，６．７，８邋ｄｅｎｏｔｅｓ邋ｈｅａｒｔ，邋ｌｉｖｅｒ，邋ｌｕｎｇ，邋ｋｉｄｎｅｙ，邋ｓｔｏｍａｃｈ，邋ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ，邋ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ邋ｆａｔ．邋ａｎｄ邋ｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓ邋ｄｏｒｓｉ．逡逑２．邋３．邋２邋ＡＬＤＨ〗Ａ１基因克隆结果逡逑ＰＣＲ产物经１．０邋％琼脂糖凝胶电泳检测结果发现，ＡＬＤＨ１Ａ丨甚因ＣＤＳ片段逡逑长１５０６邋ｂｐ，与预期扩增片段大小一致，条带明亮可用于切胶纯化，如图２．２所逡逑示。按照ＡＬＤＨ１Ａ１基因扩增的引物和反应条件进行菌落ＰＣＲ扩增鉴定。所得逡逑条带长度为载体中插入的目的片段长度１５０６邋ｂｐ，条带明亮且无杂带如图２．３所逡逑示。逡逑１５逡逑

黄牛,蛋白二级结构,蛋白信号

２．３．７延黄牛ＡＬＤＨ１Ａ１蛋白信号肽预测逡逑通过ＳｉｇｎａｌＰ软件预测延黄牛ＡＬＤＨ１Ａ】蛋白信号肽，结p}显小该蛋门在逡逑４６３处存在一个剪切位点Ｃ，在１８６处存在一个峭的位置Ｓ邋（如阁２．８所示），逡逑该处Ｓ值只有０．４４８，不是信号肽￣亚细胞分析结果－致不属于分泌性蛋白质见逡逑表邋２．６。逡逑表２．６延黄牛ＡＬＤＨ邋１ＡＩ蛋白信号肽预测数值逡逑Ｔａｈｌｅ．２．６邋Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ邋Ｖａｌｕｅ邋ｏｆ邋ＡＬＤＨ邋１Ａ１邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋Ｓｉｇｎａｌ邋Ｐｅｐｔｉｄｅ邋ｉｎ邋Ｙａｎｈｕａｎｇ邋Ｃａｔｔｌｅ逡逑测量邋Ｍｅａｓｕｒｅ逦位置邋Ｐｏｓｉｔｉｏｎ逦ｔｆｉ邋Ｖａｌｕｅ逦截止逦Ｃｕｔｏｆｆ逦信号肽邋ｓｉｇｎａｌ邋ｐｅｐｔｉｄｅｖ逡逑Ｃ－ｍａｘ逦４６３逦０．１６５逦０．３２逦ＮＯ逡逑Ｙ－ｍａｘ逦１８６逦０．１２９逦０．３３逦ＮＯ逡逑Ｓ－ｍａｘ逦１逦０．４４８逦０．８７逦ＮＯ逡逑Ｓ－ｍｅａｎ逦１－１８５逦０．０２６逦０．４８逦ＮＯ逡逑Ｄ逦１－１８５逦０．０７７逦０．４３逦ＮＯ逡逑注：Ｓ足峰值；Ｃ是剪切位点；Ｙ足Ｓ值和Ｃ值的一个参数；Ｓ－ｍｃａｎ坫从Ｎ端氨猫酸Ｉｆ始到！Ｗ切位点处各逡逑魏儕酸的ｆ均Ｓ值；Ｄ是Ｓ－ｍｅａｎ和Ｙ－ｍａｘ的ｆ均饥。逡逑－

黄牛,三级结构,蛋白信号,蛋白

【参考文献】