诱导IPEC-J2细胞自噬的猪流行性腹泻病毒非结构蛋白筛选

发布时间：2020-10-09 13:25

　　 猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可以引起急性、高度接触性肠道传染病——猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED),近年来给我国养猪业造成了巨大的经济损失。各日龄猪均可感染PEDV,其中对哺乳仔猪的危害最为严重,死亡率可达90%~100%。2010年末PEDV在我国南方地区开始流行,到2014年为止我国各地区猪场都可检出PEDV阳性。虽然国内灭活疫苗的使用在一定程度上抑制了PEDV的进一步扩散,但由于临床中不断有PEDV变异毒株的出现,传统疫苗的保护效果并不理想。PEDV仍是造成仔猪流行性急性腹泻的主要病原之一。细胞自噬(autophagy)是一种广泛存在于真核细胞中高度保守的溶酶体依赖性降解途径,对于维持细胞内环境稳态和清除损伤的细胞器至关重要。在外源性因素刺激下,自噬也可作为一种防御机制发挥作用。有研究表明自噬与癌症的发生、病原体感染等过程都具有密切的关系。许多病毒在感染宿主的过程中都可诱导细胞自噬的发生。为了探究PEDV CV777株感染IPEC-J2细胞诱导自噬的机制并筛选出参与诱导细胞自噬的PEDV关键非结构蛋白,我们展开了如下研究。首先将PEDV CV777株在IPEC-J2细胞中进行适应传代,利用透射电镜观察、Western blot检测和激光共聚焦免疫荧光等技术对PEDV是否诱导细胞自噬进行分析。结果显示PEDV感染后IPEC-J2细胞中自噬样双层膜囊泡结构增多,并诱导GFP-LC3在细胞内呈显著的点状聚集。Western blot结果表明自噬相关标志蛋白LC3-II和Beclin-1的表达明显上调,自噬底物标志蛋白p62则表现为降解趋势。说明PEDV侵染IPEC-J2细胞能诱导细胞完全自噬的发生。为了深入研究PEDV复制过程中各非结构蛋白对细胞自噬的影响,构建了PEDV各非结构蛋白的真核表达质粒,转染IPEC-J2细胞后检测各蛋白对细胞自噬的影响。结果显示PEDV非结构蛋白Nsp4、Nsp5、Nsp6、Nsp8、Nsp10、Nsp14都可上调自噬相关基因LC3-II的表达,其中Nsp5和Nsp8引起的LC3-II的聚集效果极显著。我们选取Nsp5、Nsp6和Nsp8进行诱导细胞自噬的验证,在转染pCMV-Nsp5、pCMV-Nsp6和pCMV-Nsp8的基础上,以特异性小干扰RNA(siRNAs)对Nsp5、Nsp6和Nsp8的表达进行干扰。结果显示,siRNA使Nsp5、Nsp6和Nsp8失去诱导细胞自噬的能力。此外我们发现诱导细胞自噬可促进PEDV的增殖,而抑制细胞自噬则不利于PEDV的增殖。这说明细胞自噬与PEDV的增殖也有着密切的关系。本研究证明PEDV可诱导IPEC-J2细胞自噬,而细胞自噬有利于PEDV自身的增殖,并筛选出诱导细胞自噬效果显著的关键PEDV非结构蛋白Nsp5和Nsp8。本研究对于进一步探索PEDV非结构蛋白诱导细胞自噬的机制提供了理论依据和物质基础。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.651
【部分图文】：

东北农业大学农学硕士学位论文行简介。酵母细胞中大自噬与微自噬的过程示意图见图 1-2。大自噬的四个主要的步骤：（1）起始：在内源性或外源性刺激下，与上游能量感K 连接的 ULK1 复合物引起细胞自噬的激活。（2）自噬体的延伸：自噬体 phagophore 膜的扩张和延伸产生，虽然 phagophore 的起源目前仍有争议内质网、线粒体、高尔基体等在内的细胞器膜都有助于自噬体膜形成[96体膜的闭合及自噬体与溶酶体融合的过程需要由 GTP 和 SNARE 蛋白家是在自噬体膜闭合之前除 LC3 外其他 Atg 蛋白都会从膜上脱离。（4）降融合后自噬膜内包裹的待降解底物被溶酶体内含有的水解酶给降解并被

图 3-2 PEDV 在 IPEC-J2 细胞中的生长曲线Fig. 3-2 The growth curve of PEDV in IPEC-J2 cells免疫荧光检测 PEDV 感染 IPEC-J2 细胞证 PEDV 能否感染 IPEC-J2 细胞，并观察不同浓度 PEDV 感染 IPEC--J2 细胞接种于 24 孔板中，待细胞铺满单层后用不同浓度的 PEDV 感正常细胞作为阴性对照组。感染后 36 h 以 PEDV 全病毒多抗为一抗进IFA）来检测 PEDV 在细胞内的复制情况。如图 3-3 所示，在对照组观察到荧光信号，0.01 MOI 的 PEDV 感染 IPEC-J2 细胞仅可观察到少，随着病毒浓度的增大，荧光信号的强度也随之增强。1 MOI 的 PED强于 0.1 MOI 的 PEDV，因此后续实验中 PEDV 感染 IPEC-J2 细胞的

在对照组细胞中（图3-4 A）没有观察到荧光信号，0.01 MOI 的 PEDV 感染 IPEC-J2 细胞仅可观察到少量荧光信号（图 3-4 B），随着病毒浓度的增大，荧光信号的强度也随之增强。1 MOI 的 PEDV 感染细胞的能力明显强于 0.1 MOI 的 PEDV，因此后续实验中 PEDV 感染 IPEC-J2 细胞的浓度都选用1 MOI。

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本文编号：2833740