精氨酸对肉仔鸡肠道黏膜损伤的缓解作用及机理研究

发布时间：2020-10-10 07:03

　　 本研究通过六个试验研究了日粮添加精氨酸对肠道致病菌感染的肉仔鸡肠道黏膜损伤的影响及机理。试验一旨在研究肉仔鸡空肠物理屏障相关基因表达的发育性变化。试验于肉仔鸡第1、7、14、21、28和35日龄采集空肠组织检测紧密连接和粘附连接蛋白的mRNA表达量。结果显示:1日龄时claudin-1表达显著高于其余日龄,而其他日龄之间无显著差异。Claudin-2表达在前14天逐渐增加,14-21日龄急剧下降,21-35日龄为平台期。Claudin-3表达在1-7日龄为平台期,7-21日龄逐渐升高,21-35日龄逐渐下降。Claudin-5在前21天逐渐增加,21-28日龄逐渐下降,28-35日龄为平台期。Occludin和ZO-1的发育模式相似,在1-14日龄逐渐增加,14-35日龄为平台期。ZO-2在前28天逐渐增加,28-35日龄逐渐下降。ZO-3和E-cadherin的发育模式相似,前21天逐渐增加,后 14 天逐渐降低。此外,Claudin-3、claudin-5、occludin、ZO-1、ZO-2、ZO-3 和 E-cadherin表达随日龄呈现极显著的二次曲线效应,且两两之间皆具有极显著的正相关关系。上述结果表明,1-14日龄是物理屏障相关基因(除claudin-1和claudin-3)表达的上升期,而28-35日龄是平台期(除claudin-3和ZO-2)。物理屏障相关基因表达的相关性可能由于它们结构上的相互作用。试验二旨在探究精氨酸水平与饲喂时间对患坏死性肠炎肉仔鸡的肠道免疫和屏障功能的影响。采用3×2因子随机试验设计,包括3种日粮处理:全期饲喂基础日粮(含精氨酸1.25%);全期饲喂含精氨酸1.87%日粮;前期(1-8日龄)饲喂基础日粮,后期(9-28日龄)饲喂含精氨酸1.87%日粮。2种攻毒处理为:不感染;或在第10日龄感染球虫,并在14-20日龄感染产气荚膜梭菌。于21和28日龄采样。结果显示攻毒导致肠道损伤,表现为降低血浆D-木糖浓度、提高回肠通透性、促进盲肠食糜中大肠杆菌和产气荚膜梭菌数量;精氨酸添加可缓解上述现象。攻毒降低28日龄空肠sIgA含量,而精氨酸促进其分泌。攻毒显著降低肠道claudin-1和occludinmRNA表达,而精氨酸可抑制这种现象。攻毒上调肠道中claudin-2、IFN-γ、TLR-2和NOD1 mRNA表达量,而精氨酸促进IFN-γ、IL-10和NOD1 mRNA表达量。上述结果表明,精氨酸可以通过促进固有免疫反应和维护肠道屏障功能缓解坏死性肠炎造成的肉仔鸡肠道黏膜损伤,降低产气荚膜梭菌定植。试验全期饲喂含精氨酸1.87%的日粮效果较佳。试验三旨在研究精氨酸对产气荚膜梭菌感染的肉仔鸡肠道炎症反应的影响及机制。采用2×2因子随机试验设计,包含2种日粮精氨酸浓度(1.42%和1.72%)和2个攻毒状态(不感染或14-20日龄感染产气荚膜梭菌),于21日龄和28日龄采集样品。结果显示产气荚膜梭菌感染显著升高血清降钙素原和尿素氮浓度。精氨酸添加显著降低血清二胺氧化酶、髓过氧化物酶活力和一氧化氮浓度。精氨酸添加缓解了感染引起的血清精氨酸和鸟氨酸浓度的下降,并缓解了感染引起的肠道损伤评分、空肠组织形态损伤、空肠粘膜溶菌酶酶活和iNOS酶活的提高。感染使空肠促炎细胞因子(IL-6、IFN-γ、IL-1β)和抗炎细胞因子(TGF-β)mRNA表达量升高,而精氨酸添加则降低这些细胞因子的表达。感染促进21日龄空肠抗菌肽Cathelicidins(CATH)1和CATH3mRNA表达,而降低28日龄空肠禽β防御素(AvBD)1、AvBD2、CATH3和肝脏表达抗菌肽(LEAP)2mRNA表达量。精氨酸添加降低21日龄AvBD1、AvBD2、CATH1和CATH3mRNA表达量。感染升高空肠碱性氨基酸转运载体(CAT)-1、CAT-2和CAT-3 mRNA表达量,并升高精氨酸分解酶——诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶2(ARG2)、精氨酸脱羧酶(ADC)和精氨酸:甘氨酸脒基转移酶(AGAT)的mRNA表达量;而添加精氨酸显著降低上述3种碱性氨基酸转运载体和4种精氨酸酶的过量表达。精氨酸添加显著减低感染诱导的空肠Janus激酶(JAK)1、JAK2、JAK3、信号转导子和转录激活子(STAT)1和STAT6mRNA的高表达。上述结果表明,日粮精氨酸能预防产气荚膜梭菌感染诱导的肉仔鸡循环精氨酸缺乏,使精氨酸转运和代谢恢复正常,下调激活的JAK-STAT信号通路,从而缓解炎症反应和肠道黏膜损伤。试验四旨在研究精氨酸添加对产气荚膜梭菌感染肉鸡肠道微生物区系组成和功能的影响。试验采用单因素完全随机设计,分为3个处理:对照组、产气荚膜梭菌感染组、饲喂精氨酸添加日粮的产气荚膜梭菌感染组。在14-20日龄进行产气荚膜梭菌攻毒,21日龄采集回肠食糜。结果显示3个处理的微生物区系明显不同,但对照组与精氨酸添加组的微生物结构较为相似。精氨酸能显著缓解产气荚膜梭菌感染引起的厚壁菌门丰度的下降,并显著缓解变形菌门等7种菌门丰度的升高。属水平T-test分析显示,感染引起24个属的相对丰度显著升高,且其中15个属属于变形菌门,精氨酸添加能显著抑制其中23个属。饲喂精氨酸的感染肉鸡与健康肉鸡仅有3个属的丰度显著不同。LEfSe分析显示产气荚膜梭菌攻毒组富含多种变形菌纲,而对照组富含瘤胃球菌科和格氏乳杆菌,感染情况下精氨酸添加组富含梭菌目和乳杆菌目。PICRUST(基于16S rRNA扩增子测序结果预测微生物群落功能)分析显示精氨酸可显著缓解感染引起的大多数微生物基因通路的变化,其中感染引起的代谢、人类疾病和细胞进程基因丰度的上调可被精氨酸显著抑制,感染引起的遗传信息处理和环境信息处理基因丰度的下调可被精氨酸显著促进。以上结果表明,日粮添加精氨酸可提高梭菌目和乳杆菌目等潜在有益菌的数量,减少变形菌门下的有害菌生长,抑制产气荚膜梭菌感染引起的肠道微生物代谢和人类疾病等基因丰度的增加,将感染肉仔鸡的肠道微生物菌群组成和功能调整到与健康肉仔鸡相似。试验五旨在研究精氨酸对鼠伤寒沙门氏菌感染肉仔鸡引起的肠道损伤的缓解作用。采用2×2因子随机试验设计,包含2种日粮精氨酸浓度(1.42%和1.72%)和2个攻毒状态(不感染和8-10、13-16日龄感染鼠伤寒沙门氏菌)。在17和23日龄采集样品。结果显示精氨酸添加降低感染引起的血清二胺氧化酶活力和降钙素原含量的升高。感染降低血清精氨酸浓度,补充精氨酸缓解这一现象。在感染条件下,添加精氨酸提高17日龄血清鸟氨酸和尿素氮含量。精氨酸添加缓解感染造成的肠道形态学损伤。在17日龄,感染提高空肠IL-17mRNA表达量,降低NF-κB、IFN-γ和IL-10 mRNA表达量。精氨酸添加提高空肠IFN-y并降低IL-22 mRNA表达量。在23日龄,感染提高空肠IL-1β、IL-10、IL-17、IL-8和IL-22mRNA表达,精氨酸添加提高空肠IFN-γ和IL-10 mRNA表达量并降低IL-22 mRNA表达量。感染降低17日龄空肠多种抗菌肽mRNA表达量和23日龄空肠LEAP2mRNA表达量,升高23日龄空肠三叶因子(TFF)2mRNA表达量。精氨酸添加升高17日龄空肠TFF2 mRNA表达量,降低23日龄空肠多种抗菌肽表达量但升高LEAP2 mRNA表达量。感染提高空肠CAT-1、CAT-2、CAT-3mRNA表达量,精氨酸添加继续促进三者表达增加。感染显著降低17日龄空肠ARG2 mRNA表达量,提高23日龄空肠ADC和AGAT mRNA表达量,精氨酸添加继续促进23日龄ADCmRNA表达量。以上结果表明,沙门氏菌感染造成循环精氨酸缺乏,促进精氨酸转运,诱导炎症反应。精氨酸添加维护肠道形态,缓解沙门氏菌感染的不利影响,促进精氨酸转运载体表达并调节细胞因子和抗菌肽表达,尤其是促进IFN-y产生,有利于细胞内沙门氏菌的清除。本试验与试验三的结果比较可知,产气荚膜梭菌感染和沙门氏菌感染都可引起机体循环精氨酸缺乏,诱发全身炎症反应和肠道损伤,促进肠道碱性氨基酸转运载体表达。日粮补充精氨酸都可增加机体循环精氨酸浓度,缓解肠道损伤。但两种疾病模型的病理过程不同:产气荚膜梭菌在感染前期即可诱发肠道炎症反应,感染后期肠道炎症反应减弱;而沙门氏菌在感染前期使IFN-γ、NF-κB和大量抗菌肽表达下降,可能有助于沙门氏菌逃避机体免疫系统清除,感染后期诱发肠道炎症反应。精氨酸的调节机制也有所不同:在产气荚膜梭菌感染中,精氨酸缓解了精氨酸分解酶、促炎细胞因子、抗炎细胞因子和抗菌肽等的过度表达,这种调节作用是一致的,可能与提高循环精氨酸浓度进而反馈抑制肠道精氨酸过度转运有关;而在沙门氏菌感染中,精氨酸对不同分子的调节作用不同,精氨酸发挥保护作用可能与促进IFN-γ、增强T细胞数量和功能有关,具体机制有待进一步研究。试验六旨在研究精氨酸对产气荚膜梭菌感染的鸡胚肠上皮细胞炎症反应的影响。结果显示产气荚膜梭菌感染对细胞毒性、IL-1β、IL-6、IL-8和iNOS mRNA表达量的提高具有具有剂量和时间依赖性。适于构建感染模型的剂量和时间分别是感染复数为1,处理4h。50和/或400μM精氨酸可显著抑制产气荚膜梭菌感染引起的细胞毒性、碱性氨基酸转运载体(CAT-1和CAT-3)、iNOS和炎性细胞因子(IL-1β、IL8和IL10)的基因表达量的升高,继续升高感染刺激的IFN-γ和ARG2 mRNA表达。400μM比50μM精氨酸更利于缓解炎症。以上结果表明,精氨酸可通过缓解产气荚膜梭菌感染诱导的CATs、iNOS及炎性细胞因子的增加来减少鸡胚肠上皮细胞的死亡,与试验三动物试验结果基本一致。以上研究表明,日粮精氨酸可通过增加机体循环精氨酸浓度,影响肠道精氨酸转运和代谢,调节肠道免疫反应和抗菌肽表达,改善肠道机械屏障功能,调节肠道微生物菌群组成和功能,缓解肠道致病菌造成的肉仔鸡肠道黏膜损伤。精氨酸添加日粮在全期饲喂的效果优于仅在感染期饲喂的效果。
【学位单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S831.5
【部分图文】：

２．１精氨酸的结构与性质逡逑精氨酸（Ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ａｒｇ），化学名称为２－氨基－５－胍基戊酸，是一种碱性氨基酸。其分子式为逡逑Ｃ６Ｈ１４Ｎ４０２，分子量为１７４．２０，结构如图１所示。最早于１８８６年由Ｓｃｈｕｌｚｅ从羽扇豆芽苗中分离逡逑并命名，１８９５年Ｈｅｄｉｎ从动物蛋白中分离出精氨酸。精氨酸有Ｄ型和Ｌ型两种同分异构体，仅逡逑Ｌ型在生物体内具有生理作用。逡逑Ｈ逦Ｈ邋ＮＨ２逡逑ＮＨ逦Ｏ逡逑图１精氨酸的结构逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋Ｉ邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ａｒｇｉｎｉｎｅ逡逑人和晡乳动物在正常情况下体内合成的精氨酸可满足自身生长发育需要，但在某些情况下，逡逑如幼龄、孕期、创伤和严重败血症，内源合成的精氨酸不能满足需要，需要外源补充精氨酸（Ｇｏｂｅｒｔ逡逑等，２００４；邋Ｃｈａｕ等，２０１３），因此精氨酸是人和哺乳动物的条件性必需氨基酸。由于家禽缺乏氨逡逑１逡逑

逦第一章文献综述逡逑肠道是维持肠道内环境平衡和阻碍致病菌及毒素的先天性屏障。肠道屏障包括机械屏障、化逡逑学屏障、微生物屏障和免疫屏障（如图３）。逡逑机械屏障又叫物理屏障，其生理结构基础是黏膜上皮、固有层和黏膜肌层。肠上皮细胞通过逡逑细胞连接紧密排列，细胞之间的连接由紧密连接、黏附连接和桥粒等组成，能有效的阻挡细菌、逡逑病毒及内毒素进入。逡逑化学屏障由肠上皮细胞所分泌的粘液、消化液及正常菌分泌的抑菌物质组成。肠粘膜上皮细逡逑胞夹杂着大量的杯状细胞，杯状细胞分泌粘液，枯液层呈半透明状，连续分布于肠黏膜表面，与逡逑肠道上皮细胞结合位点竞争，阻碍细菌与肠上皮结合。肠道抑菌物质主要有胆汁、粘多糖、溶菌逡逑酶和糖蛋白等。胃酸呈酸性，可杀灭从口腔进入的大部分细菌，酸性环境可起到保护肠道免受病逡逑原菌感染的作用。肝脏分泌的胆汁和小肠液对病原菌增殖也具有一定的抑制作用。逡逑肠道菌群主要包括黏膜菌群和肠腔菌群，黏膜菌群主要以双歧杆菌和乳酸菌为主，肠腔菌群逡逑多为大肠杆菌和肠球菌，它们黏附在肠道黏膜层上，形成了一个多层次的肠道微生物屏障。正常逡逑情况下肠道微生物数量、分布相对恒定

（＆＞ｎｄａＳｐｐ．）在诱导坏死性肠炎病变中具有协同作用。与仅感染艾美尔球虫或仅感染产气荚膜逡逑梭菌的肉鸡相比，产气荚膜梭菌与艾美尔球虫卵或与过量含有弱毒艾美尔球虫疫苗共同感染导致逡逑更多肉鸡出现病变或死亡率更高（Ｐａｒｋ等，２００８；邋Ｐｅｄｅｒｓｅｎ等，２００８）。如图４所示，当存在球虫逡逑病时，坏死性肠炎发病过程如下（Ｔｉｍｂｅｒｍｏｎｔ等，２０１１）：艾美尔球虫在小肠中定植并杀死肠上逡逑皮细胞，由此产生的肠上皮细胞之间的缝隙使血浆蛋白渗漏到肠腔中，产气荚膜梭菌可利用血浆逡逑蛋白作为其生长基质。此外，球虫感染诱导Ｔ细胞介导的炎症反应，能促进肠道粘液生成（步骤逡逑Ｂ），由于产气荚膜梭菌能以粘液为底物，因此粘蛋白合成增加也为产气荚膜梭菌提供了有利的生逡逑长条件。致病性产气荚膜梭菌菌株通过产生细菌素而抑制其他产气荚膜梭菌菌株，尽可能地获得逡逑由球虫感染而增加的营养物质（步骤Ｃ）。坏死性肠炎的病理变化始于肠上皮细胞的基底测和外逡逑侧区域，然后逐渐扩展到整个固有层。宿主胶原酶和由致病性产气荚膜梭菌分泌的胶原蛋白水解逡逑酶可能在此过程中起作用（步骤Ｄ）。ＮｅｔＢ可使肠细胞产生小孔，导致细胞死亡，从而诱发坏死逡逑性病变（步骤Ｅ）。细胞外基质分子（ＥＣＭＭ

本文编号：2834889