貂源肺炎双球菌和金黄色葡萄球菌的毒力基因检测及其致病性研究

发布时间：2020-10-10 07:15

　　水貂是重要的经济动物之一,已发展形成重要的养殖产业。山东省是水貂养殖第一大省,但是随着集约化、规模化养殖模式的形成,疫病严重妨碍了水貂养殖业的健康发展,造成了很大的经济损失。出血性肺炎是危害水貂的重要疫病之一。近年来,本实验室对水貂出血性肺炎进行了流行病学调查,结果表明,除了绿脓杆菌、克雷伯菌、巴氏杆菌等致病菌外,应该还有其他的病因。为此,本研究对肺炎双球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pneumoniae)和金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus,S.aureus)在水貂群中的流行情况进行了调查,并对其致病性进行研究,阐明两者在水貂出血性肺炎中的作用。自2017-2018年期间,从山东诸城水貂养殖场采取水貂肺炎病料120份,共分离到2株肺炎双球菌(Sp-1,Sp-2)和3株金黄色葡萄球菌(Sa-6,Sa-16,Sa-24)。采用分子克隆测序技术,分别对所分离的肺炎双球菌的9种毒力基因、金黄色葡萄球菌的17种毒力基因进行检测、分析。结果表明,2株肺炎双球菌均携带ply、nan A、lyt A、psp A、psa A及rrg A基因,Sp-1分离株还携带有pav A,hys A毒力基因,而iga基因均为阴性;3株金黄色葡萄球菌分离株中,Sa-16,Sa-24分离株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),Sa-6分离株为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA),其中MSSA携带pvl基因,3株金黄色葡萄球菌均携带coa、nuc和clf A基因,其中,Sa-6,Sa-24两株同时携带hla、hlb、hld和hlg 4种溶血素基因及Fnbp B毒力基因,肠毒素作为食物中毒病例中重要的致病因素之一,在本研究中只有Sa-6分离株肠毒素seb、seg基因检测为阳性,表皮剥落毒素基因eta、etb及tsst-1均未检出。采用纸片扩散法对5株细菌的耐药性进行了检测,共使用9大类共21种抗生素。本研究中Sp-1,Sp-2分离株对罗红霉素完全耐药,对哌拉西林、头孢噻肟、头孢他啶、头孢西丁、庆大霉素和阿米卡星均敏感。2株MRSA菌株相较于不携带mec A基因的菌株,MRSA菌株对临床上常用的抗生素具有更高程度的耐药性,对青霉素类(氨苄西林、青霉素)和磺胺类(复方新诺明)药物完全耐药,只有部分喹诺酮类(环丙沙星、诺氟沙星)、头孢菌素类(头孢他啶、头孢西丁)药物对Sa-16,Sa-24分离株显示较好的抑菌作用。Sa-6分离株对复方新诺明完全耐药,喹诺酮类、硝基呋喃类、糖肽类及多数头孢菌素类药物均对MSSA分离株显示较好的抑菌作用。根据分离菌株毒力基因检测结果,分别选取肺炎双球菌分离株Sp-1和金黄色葡萄球菌分离株Sa-6进行致病性研究。在小鼠致病性试验中,通过腹腔接种途径对小白鼠进行攻毒试验,结合临床症状观察及小鼠发病时间和死亡率数据统计,结果表明,Sa-6分离株对小鼠的致病性比Sp-1分离株强。之后,回归实验动物,将Sp-1分离株和Sa-6分离株分别通过腹腔接种、肌肉注射和鼻腔接种共3种不同攻毒途径感染水貂。根据感染水貂不同器官中目的菌回收率,并结合组织病理学变化,确定了分离株对水貂具有致病性,同时比较肺炎双球菌和金黄色葡萄球菌经不同途径感染,其对水貂致病性强弱的差异。结果表明:肺炎双球菌分离株经鼻腔感染水貂,病原菌更易通过在鼻咽部的定植,进而从鼻咽部经呼吸道下行,引起肺部感染,而金黄色葡萄球菌分离株则易经破损的皮肤感染水貂,引起水貂化脓性感染、蜂窝织炎等。本研究表明,肺炎双球菌和金黄色葡萄球菌在貂群中存在,并可引起水貂肺炎病征。这一结果丰富了水貂出血性肺炎的研究数据,具有重要的公共卫生学意义和生产实践意义。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.61
【部分图文】：

肺炎双球菌,金黄色葡萄球菌,鉴别培养基,水貂

山东农业大学硕士学位论文验结果菌的分离鉴定 120 份水貂肺炎病料中分别采取心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏，无菌操线接种于 LB 固体培养基平板，进行细菌的分离及鉴别培养基培养，纯培氏染色镜检（图 3），将疑似为肺炎双球菌和金黄色葡萄球菌的纯培养菌保存菌种。A B

电泳图,16SrRNA基因,电泳图,菌株

图 3 分离菌株革兰氏染色镜检图（A：肺炎双球菌，B：金黄色葡萄球Gram's staining microscope（A. Streptococcus pneumoniae, B. Staphyloco离菌株的基因组 DNA，以 16S rRNA 为引物扩增细菌进行 1％琼脂糖凝胶电泳，片段大小（1500 bp）与预段的凝胶按照Gel Extraction Kit 试剂盒说明书进行胶果提交 NCBI 进行 BLAST 相似性比对分析，最终确定株肺炎双球菌和 3 株金黄色葡萄球菌。2000M 1 2 3 4 5 6bp

电泳图,肺炎双球菌,毒力基因,凝胶电泳

貂源肺炎双球菌和金黄色葡萄球菌的毒力基因检测及其致病性研究检测双球菌和金黄色葡萄球菌的目的菌株，分别采用 PCR。肺炎双球菌主要毒力因子有溶血素、神经氨酸酶（包自溶酶、肺炎球菌表面蛋白（分为 A、C 两种），肺炎毒力因子 A、菌毛和透明质酸酶等（图 5）。金黄色葡溶血素（分为α、β、γ、δ-溶血素四种），杀白细胞肠毒素）、毒性休克综合征毒素-1、表皮剥脱毒素（分固酶、凝聚因子、耐热核酸酶及耐甲氧西林抗药性基因增产物进行 1％琼脂糖凝胶电泳验证该菌株是否含有目的黄色葡萄球菌的部分毒力基因 PCR 扩增产物电泳图如bpM 1 2 3 4 5 6 7 8 9

【参考文献】