miR-26b-5p调控鹅卵泡颗粒细胞增殖作用机制研究

发布时间：2020-10-10 21:38

　　 鹅卵泡发育是影响母鹅产蛋量的重要因素,卵泡颗粒细胞的状态是决定鹅卵泡发育的首要条件,在等级前卵泡中颗粒细胞增殖与分化可以保证等级前卵泡的正常发育成熟并进入等级阶段。然而,只有不到1%的等级前卵泡会被选择成为优势卵泡,绝大部分卵泡会因为卵泡颗粒细胞大量凋亡而发生闭锁。可见探究卵泡颗粒细胞增殖的调控机制有利于保证卵泡正常发育,增加优势卵泡数量并提高产蛋量。miRNAs利用种子序列区与靶基因3'UTR区部分结合或完全互补配对调控靶基因的转录从而影响细胞增殖与卵泡发育。实验室前期small RNA测序证实miR-26b-5p在鹅产蛋期与就巢期表达存在显著差异,预测miR-26b-5p靶基因富集于TGF-β/SMADs信号通路。因此,我们提出miR-26b-5p调控鹅卵泡颗粒细胞增殖的假设。基于此在本试验中首先探讨了 miR-26b-5p对鹅卵泡颗粒细胞增殖的影响,进而深入探究miR-26b-5p介导TGF-β/SMADs信号通路发挥其生物学功能及转录调控机制。本研究旨在揭示miR-26b-5p参与鹅卵泡颗粒细胞增殖的作用机理,同时也为提高母鹅产蛋量提供一定的理论依据。主要结果如下:1、miR-26b-5p调控鹅卵泡颗粒细胞增殖,促进雌激素分泌。为揭示miR-26b-5p对鹅卵泡颗粒细胞增殖的影响,在分离的原代细胞中分别转染miR-26b-5p mimics和miR-26b-5p inhibitor,利用CCK-8与流式细胞术分别检测细胞增殖与凋亡。结果显示,转染miR-26b-5pmimics后颗粒细胞增殖率显著上升81.2%(P0.05),而转染miR-26b-5p inhibitor后细胞增殖被抑制且细胞凋亡显著上升28%(P0.01)。qRT-PCR结果显示,转染miR-26b-5p mimics后抗凋亡基因BCL-2 mRNA表达量显著上调而促凋亡基因Caspase-3表达量显著降低,而转染miR-26b-5p inhibitor后呈现相反趋势(P0.01)。此外,ELISA检测结果表明,转染miR-26b-5p mimics可以显著增加雌激素分泌水平、降低孕激素水平,而转染miR-26b-5pinhibitor后同样表现出相反趋势(P0.05)。综上所述,miR-26b-5p可以促进鹅卵泡颗粒细胞增殖,增加颗粒细胞雌激素分泌量,降低孕激素分泌量。2、miR-26b-5p靶向INHBB促进卵泡颗粒细胞增殖。为揭示miR-26b-5p促进卵泡颗粒细胞增殖的作用方式,利用相关网站预测发现INHBB和SMAD4为miR-26b-5p的潜在靶基因。结合双荧光素酶基因报告系统,发现miR-26b-5p可与鹅INHBB 3'UTR结合并极显著抑制荧光素酶活性(P0.01),而SMAD4荧光素酶活性没有发生显著变化。进一步利用qRT-PCR和Western Blot等方法证实miR-26b-5p可以显著降低INHBB表达(P0.05)。此外通过ELISA分析发现miR-26b-5p可以显著减少鹅卵泡颗粒细胞抑制素分泌量(P0.01)。基于以上结果,发现miR-26b-5p通过靶向抑制INHBB表达参与调控鹅卵泡颗粒细胞增殖。3、转录因子SMAD4调控miR-26b-5p转录参与鹅卵泡颗粒细胞增殖。为阐明miR-26b-5p参与鹅卵泡颗粒细胞增殖的分子机制,通过qRT-PCR并利用Promoter Scan网站预测发现过表达SMAD4可以极显著增加miR-26b-5p表达量(P0.01),miR-26b-5p基因启动子区存在3个SMAD4结合位点(SBE1:-827--815,SBE2:-796--784,SBE3:-298--286)。双荧光素酶试验证实转染含SBE3的片段后荧光活性显著增强(P0.01),因此SMAD4可作为miR-26b-5p的一种转录因子。为深入探究SMAD4介导miR-26b-5p在鹅卵泡颗粒细胞增殖过程中的作用,选择了SMAD4 所在TGF-β/SMADs信号通路的上游抑制剂,发现特异性阻断剂能显著下调鹅卵泡颗粒细胞SMAD4 mRNA和miR-26b-5p表达量(P0.05),极显著上调INHBB表达量(P0.01);细胞凋亡率显著增加62.23%(P0.05),E2分泌水平显著减少而P4及抑制素B分泌水平显著增加(P0.05)。以上结果充分说明TGF-β/SMADs信号通路参与调控鹅卵泡颗粒细胞的增殖,通路关键因子SMAD4可以作为转录因子调控miR-26b-5p转录。综上所述,miR-26b-5p受转录因子SMAD4转录调控,并通过靶向INHBB介导TGF-β/SMADs信号通路,促进鹅卵泡颗粒细胞的增殖。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S835
【部分图文】：

妒於◎警義三繼??Ｏｏｇｏｎｉａ?Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ?Ｐｒｉｍａｒｙ?Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ??Ｔｅｒｔｉａｒｙ??Ｐｒｅｏｖｕｌａｔｏｒｙ??图１－１卵泡发育序列图［６］??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１?Ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ?ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ＾??卵泡发生起源于原始卵泡，禽类的原始卵泡发育于出生前胚胎期或出生后立即形成。??原始卵泡是卵巢上数量最多、体积最小的卵泡，位于卵巢表面，细胞结构简单，内层是未??分化的初级卵母细胞，外层由单层扁平颗粒细胞所包围。随着雌禽发育至性成熟，原始卵??泡被激活，扁平颗粒细胞生长发育成立方体时，标志着该原始卵泡成为初级卵泡［３］。初级??卵泡无卵泡膜结构，其卵母细胞与颗粒细胞持续生长，体积随之增大。之后初级卵泡生长??发育速度加快，外层基膜组织分化成为卵泡膜结构，颗粒细胞层增殖分化为２－３层，卵泡??内开始聚集卵黄物质，至此初级卵泡进入次级阶段。次级卵泡卵泡膜分化成为卵泡膜外层??与卵泡膜内层

与卵泡膜内层，此时的卵泡颗粒细胞层数减少为单层但单个颗粒体积增大，卵母细胞内出??现空腔并堆积大量营养丰富的卵黄物质，这些卵黄物质使得卵泡体积进一步增大而突出卵??巢基质，由结缔组织组成的卵泡柄与卵巢连接，由此卵泡进入成熟阶段（图１－２）?［７４］。禽??类与哺乳动物不同，排卵后并不生成真正的黄体，而是形成由结缔组织、上皮样组织和排??卵后残留在卵巢内的碎屑组成的囊泡称为排卵后卵泡（ｐｏｓｔ－ｏｖｕｌａｔｏｒｙｆｏｌｌｉｃｌｅ，ＰＯＦ）。排卵??后卵泡仍依附在卵巢基质上，短时间内还保留一部分类固醇激素分泌功能，在排卵后１０天??内逐渐萎缩并完全丧失其功能后被卵巢吸收［１（）］。??議?ＪＪＩ?ｍ??纖带?一卜’，平’、??图１－２母鸡成熟卵泡完整结构示意图［７］??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｃｏｍｐｌｅｔｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｈｅｎ?ｍａｔｕｒｅ?ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ１７１??

的协同作用。??卵泡生长发育接收来自上游垂体分泌性激素的影响，同样的来源于卵泡的类固醇激素??对下丘脑－垂体存在着反馈机制（图１－４）。卵泡内分泌的雌激素可以与ＦＳＨ协同作用与卵??泡，刺激卵泡颗粒细胞大量增殖并促进初级卵泡发育成更高等级的卵泡，于此同时雌激素??被分泌进入血液循环后作用于下丘脑以及垂体，抑制ＧｎＲＨ、ＦＳＨ和ＬＨ的分泌。禽类卵??泡发育另外一个重要的类固醇激素－孕激素主要由卵泡颗粒细胞分泌，低浓度的孕激素有利??于卵泡的发育与排卵，而大剂量的孕激素会作用于垂体，抑制ＦＳＨ与ＬＨ的分泌量，影响??着卵泡发育与排卵。除此之外，卵泡颗粒细胞还可以分泌激活素（Ａｃｔｉｖｉｎｓ）及抑制素??（Ｉｎｈｉｂｉｎｓ）两种糖蛋白激素，这两种激素都属于ＴＧＦ－Ｐ超家族但功能却不同，激活素刺激??垂体释放更多的ＦＳＨ而抑制素却与之相反，通过负反馈调控垂体释放ＦＳＨ进而抑制小卵??泡生长发育。?
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本文编号：2835623