弓形虫Chinese I株BIN3蛋白的生物学特性研究

发布时间：2020-10-10 13:19

　　 刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是呈世界性分布的重要的细胞内寄生虫,能够感染几乎所有的恒温动物。目前世界范围内弓形虫的种群结构具备丰富的种系和不同虫株间的杂交系,其基因型存在高度地域差异。流行于中国地区的弓形虫大部分属于非典型基因型中的Chinese I(TOXODB#9)谱系。Chinese I基因型虫株与其他虫株相比较可能具备独特的致病性,也许会引起宿主差异的免疫反应。弓形虫致病机制的中心环节之一是弓形虫速殖子与缓殖子的相互转化。二者在形态上区别很小,但分子水平存在显著差异,通过对期特异基因分子水平上的鉴定,可以确定弓形虫所处的特定时期。果蝇的BIN3蛋白(Bicoid-Interacting Protein 3)在果蝇胚胎发育中起重要作用,弓形虫中的BIN3蛋白,经序列对比发现其核心序列与果蝇BIN3蛋白的核心序列具有相似性,因此预测弓形虫BIN3蛋白与虫体发育或虫体极性作用相关。然而目前关于弓形虫BIN3蛋白的研究仅限于在线预测,对于Chinese I基因型虫株BIN3蛋白的研究更是空白。本研究观察了Chinese I基因型Wh3虫株BIN3蛋白的定位及其对Chinese I虫株免疫保护作用,并进行了Chinese I基因型Wh3虫株BIN3基因敲除株的初步构建,为深入研究弓形虫Chinese I基因型的防治奠定基础。生物信息学分析通过NCBI、TOXODB在线数据库及Expasy、CBS等网站提供的在线软件初步分析BIN3蛋白,包括基础理化性质、二级结构和转录后修饰作用等。结果显示BIN3蛋白理论上分子量为84.38kD;理论等电点(PI)为7.65;该蛋白无跨膜结构,不含信号肽。BIN3蛋白定位在细胞核的概率为78.3%。BIN3蛋白具备3个N端糖基化位点;阈值水平上具备6个酪氨酸残基,和多个丝氨酸、苏氨酸残基;存在酰基化。BIN3蛋白二级结构包含螺旋、片层、转角和卷曲结构。其中在该段蛋白前段、后端,螺旋结构与片层结构较为丰富,且穿插结合;卷曲结构主要集中在中部;转角结构均匀分布在该段蛋白。抗BIN3蛋白单抗制备设计相应引物,在Chinese I基因型Wh3虫株中获得BIN3基因克隆,构建pET28a-BIN3表达载体,表达蛋白并经细胞融合等方法制备相应单抗。结果获得3株单克隆细胞株抗体,分别命名为AbM-BIN3:#43,AbM-BIN3:#7和AbM-BIN3:#42。AbM-BIN3:#42接近1:100,000,0,AbM-BIN3:#43和AbM-BIN3:#7均可达到1:100,000,0单位以上,AbM-BIN3:#43效价相对较高。BIN3蛋白在Chinese I基因型Wh3虫株中的定位虫体复苏后,传代2-3代,改变体外培养环境使虫体处于碱性条件(pH=8.2)下培养。以速殖子期特异基因SAG1,缓殖子期特异基因BAG1,SAG2C作为鉴定基因,判定Wh3株是否被诱导成囊。通过间接免疫荧光技术对BIN3蛋白进行定位,观察BIN3蛋白在虫体中的定位情况。结果发现弓形虫Chinese I基因型Wh3虫株在体外碱性诱导条件下可以成囊,经过SAG1、BAG1和SAG2C期特异基因的鉴定证实,被诱导虫株可表达缓殖子相关基因。BIN3蛋白在该虫株中的速殖子和缓殖子时期均可以转录表达。BIN3蛋白定位位置存在差异,游离状态速殖子BIN3蛋白定位于虫体细胞质内;假囊状态的速殖子BIN3蛋白分泌到虫体外部,囊膜内部;BIN3蛋白分布于包囊的囊壁内部。BIN3蛋白在碱性条件诱导的缓殖子中表达量高于速殖子。BIN3重组蛋白对Chinese I基因型Wh3株弓形虫的免疫保护将BIN3重组蛋白以50μg/只的剂量对6周龄雌性Balb/c小鼠进行皮下多点注射,免疫程序为3次,免疫结束后2周,检测体液免疫与细胞因子水平。流式细胞仪检测脾淋巴细胞增殖状态。并对小鼠进行攻虫试验,除阴性对照组外,每只小鼠接种Chinese I基因型Wh3虫株速殖子1×10~5个,观察发病状态及记录死亡时间。结果发现BIN3重组蛋白免疫小鼠后引起小鼠IgG水平上升(P0.05),细胞因子IL-2和IFN-γ水平提高(P0.05)。致死剂量(1×10~5个)Wh3虫株速殖子接种小鼠后,BIN3重组蛋白免疫组比阳性对照组病程延缓72h。Chinese I基因型Wh3虫株BIN3基因敲除株构建利用CARSPR/Cas9系统构建BIN3核心序列的敲除虫株。设计BIN3-gRNA引物,构建pSAG1-Cas9-suprt质粒;构建DHFR短同源臂序列,以乙胺嘧啶进行药物筛选,并通过分子水平和蛋白水平鉴定BIN3基因敲除株是否构建成功。PCR结果显示DHFR片段成功插入BIN3基因,Western blot结果显示相应蛋白未见表达。成功构建Wh3株BIN3基因敲除虫株。Vero细胞中Chinese I基因型BIN3基因敲除株生长速度较野生株缓慢。接种虫株72h后二者虫体数量差异最为明显(P0.05);120h后BIN3基因敲除株虫体数量与野生株相比相差约1.25×10~6。通过对BIN3基因敲除株噬斑形成能力、入侵能力和逸出能力的测定发现,BIN3不会影响速殖子的入侵和逸出,但噬斑形成收到影响,与虫体发育有相关性。Chinese I基因型BIN3敲除株接种小鼠死亡时间较野生株延迟24h,BIN3基因的敲除对Chinese I基因型弓形虫致病力具一定影响。本研究通过诱导弓形虫Chinese I基因型Wh3非成囊株在体外成囊,观察发现BIN3蛋白在速殖子和缓殖子两个时期均可表达。免疫保护试验表明BIN3蛋白对Chinese I基因型Wh3虫株具有较好免疫保护作用。通过构建BIN3基因敲除株发现BIN3基因对弓形虫发育有一定影响。从而为深入研究我国弓形虫病防治提供了依据。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.72
【部分图文】：

弓形虫 BIN3 基因的核心序列与果蝇 Bicoid 基因相关蛋白 BIN3 核有相似性（见图 1.2）。同时，我们考虑到弓形虫并没有胚胎，因此预测中发现的 BIN3 基因，是与弓形虫的虫体发育或者虫体的极性作用相关

形虫阳性检出率则为 2.90%。其中雄性狐狸感染率为 7.14%，雌性为 8.70%。基因型只有两种，Chinese I 和 TOXODB#10[119]。总结中国各个地区的弓形虫基因型流行调查中，Chinese I（TOXODB本数的 65.5%。见图 1.1[95]。

BIN3氨基酸含量
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本文编号：2835252