酿酒酵母菌细胞壁蛋白粗提物诱导绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1表达的研究

发布时间：2020-10-10 13:17

　　 目前抗生素滥用对人和动物健康造成的损害以及对环境的破坏日益突出,这种情况迫使研究人员不断寻找可以替代抗生素的物质。防御素在替代抗生素方面拥有无限潜能,是一类具有广谱抗微生物活性的小分子天然免疫抗微生物肽(Antimicrobial peptides,AMPs)。β-防御素是防御素家族中分布最广的一类防御素,广泛分布于哺乳动物、禽类和鱼类体内,而绵羊β-防御素-1(sheep beta defensin-1,SBD-1)是绵羊胃肠道内分布最为广泛的防御素,尤其在绵羊瘤胃中高度表达。本试验在mRNA和蛋白水平研究酿酒酵母菌细胞壁蛋白粗提物对绵羊瘤胃上皮细胞(ovineruminal epithelia cells,ORECs)SBD-1 表达的影响。试验首先对 ORECs进行体外培养;用超声破碎法将培养的酿酒酵母菌破碎以提取细胞壁,再运用复合酶法提取细胞壁蛋白粗提物;然后以浓度为0、12.5、25、50和100μg/mL的酿酒酵母菌细胞壁蛋白粗提物刺激ORECs 2、4、8和12 h;最后通过实时荧光定量PCR技术(quantitative real-time PCR,qPCR)和酶联免疫吸附测定试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测不同浓度的酿酒酵母菌细胞壁蛋白粗提物诱导ORECs不同时间后SBD-1 mRNA和蛋白的表达变化。结果表明:本试验在体外成功的培养了 ORECs,且当原代细胞生长到第12 d时基本将细胞培养瓶瓶底铺满。运用复合酶法所提取的酿酒酵母菌细胞壁蛋白粗提物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测符合显色范围。且不论在mRNA还是蛋白水平上,酿酒酵母菌细胞壁蛋白粗提物都可以诱导ORECs SBD-1的表达,且当酿酒酵母菌细胞壁蛋白粗提物浓度为100 μg/mL诱导ORECs 12 h时,SBD-1的表达量达到最大。
【学位单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S816
【部分图文】：

本试验是检测酿酒酵母菌细胞壁蛋白粗提物对ＯＲＥＣｓ分泌的ＳＢＤ－１蛋白的影??响。收集之前刺激不同时间的上清液，按照武汉新启迪生物科技有限公司绵羊防御素??Ｐ１ＥＬＩＳＡ试剂盒说明书步骤进行本试验，具体试验步骤如图２。??Ｉ??

当胰蛋白酶对瘤胃组织的消化时间改变时，消化液中的细胞形态也随之发生变化。??当显微镜视野内不规则片状细胞减少，圆而亮的细胞逐渐增多时，开始收集。本试验??从第３次开始收集（图３），收集到第７次后停止消化，期间每次消化后的细胞都用??同等体积的含有２０％血清的培养基终止消化，最后将细胞离心培养。??＇?＂?：?／．＇广?ｕ．：．?．?■：；，?．?■．?．乂．：，：：：：．．，；??：歉：：?Ｖｉ?？雙／：：：??？?．??＇＇?＾?Ｘ＆－＇??＇?八．ｙ?＂■??Ａ?＇?１〇Ｑ?－??图３第３次消化后的消化液情况??Ｆｉｇｕｒｅ?３?Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ?ｊｕｉｃｅ?ａｆｔｅｒ?ｔｈｅ?ｔｈｉｒｄ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ??３．?２?ＯＲＥＧｓ原代以及传代细胞培养结果??培养到第５?ｄ的细胞在显微镜下观察发现有单个或呈小团状的贴壁细胞，细胞形??态正常（图４Ａ）；培养９ｄ后的细胞连成大片集落生长，但集落之间仍有较大空隙（图??４Ｂ）；培养Ｉ２ｄ后可见细胞生长形态正常，细胞岛屿之间基本没有空隙，完全连接，??此时即可进行传代培养（图４Ｃ）。然后使用胰蛋白酶消化液对原代贴壁细胞进行消化??再培养

ＮＡ浓度测定与分析??提取的ＯＲＥＣｓＲＮＡ用多功能酶标仪进行检测，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值都度在２００?ｎｇ／ｐＬ左右，说明本次试验提取的ＲＮＡ纯度和浓度都符合下。??ＣＲ结果（扩增曲线和熔解曲线）??ＣＲ扩增曲线如图６所示，从图中可以看出本试验扩增效果良好，曲线
【参考文献】

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本文编号：2835251