猪链球菌致STSLS相关转录因子的筛选及其调控机制的研究

发布时间：2020-10-10 11:08

　　 猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一种重要的致人畜共患病病原,主要分布在亚洲及欧洲地区,在其余大洲也有零星报道。该菌目前按血清型分型共计29个血清型,其中血清型2型(SS2)被广泛报道为S.suis主要致病血清型。从有报道以来,S.suis已在全球各洲造成上千人感染,幸存者也会留下多种后遗症。它更是东南亚地区造成脑膜炎的主要细菌病原,给人类公共卫生带来了极大的威胁。尤其在中国SS2出现过两次爆发,极高的死亡率和伴随的中毒样休克综合征(Streptococcus toxic shock like syndrome,STSLS)引起了世界广泛关注。病原菌在侵入宿主致病的过程中,其毒力相关因子会随着外界环境的变化而发生变化,这都要依靠转录因子来调节。本研究对SS2中89K上的转录因子进行了筛选,并针对其中一个转录因子调控机制进行了研究,主要研究结果如下:1.筛选到一个影响猪链球菌致STSLS的转录因子通过宿主体内诱导表达,我们发现候选的8个转录因子大部分发生了上调,对其逐一缺失并通过小鼠实验确认,发现其中一个转录因子tstS的缺失使SS2致病力大幅下降。由于其位于89K毒力岛上,我们检测了该缺失突变株对小鼠巨噬细胞炎性因子的刺激,发现其能力有显著的下降。进一步检测小鼠血中含菌量及血清中炎性因子含量证实,缺失tstS后其宿主体内存活及激发高炎性因子的能力较显著地减弱。但由于感染早期缺失突变株反而能够引起宿主高炎性及之后的清除,我们以不含该基因的欧洲标准株P1/7作为母本,将其导入过表达。结果显示,获得tstS后,P1/7菌株同样获得了激发高炎性因子的能力。结果显示tstS的存在能够提高菌株感染急性期促炎能力,对SS2致STSLS起着重要作用。2.发现tstS影响SS2的调控机制为了深入研究tstS影响SS2致STSLS的机制,我们通过基因芯片筛选缺失突变株△tstS与野生株05ZY的差异基因。经GO分析发现,大部分基因属于细菌代谢相关,此外还有Sspep、Fhb、Fhbp、SSU05_2103四个已被证实的猪链球菌表面毒力相关因子。而体外模拟环境刺激发现,在葡萄糖匮乏的环境下,tstS的转录水平会进一步上升。经凝胶迁移实验(EMSA)验证,tstS受CcpA调控。结合本实验室前期研究,我们推测TstS与Fhbp以及CcpA间存在一定的联系。将tstS启动子区CcpA结合序列插入tstS缺失突变株中Fhbp启动子区后,我们发现其葡萄糖摄取能力得到了恢复,致病力也有一定的加强。因此我们确认TstS通过Fhbp这个媒介与CcpA存在反馈调节,促进了SS2对低葡萄糖浓度环境的适应,增强了在该环境下荚膜等毒力相关因子的表达来逃避宿主免疫系统清除,即使葡萄糖浓度极低的情况下,TstS同样能够通过其调控的Fhb以及Fhbp来完成免疫逃避。同时这是有关CcpA调控的新机制,为认识和理解CcpA调控的精细化提供了新的视角。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.61
【部分图文】：

CPS 能够阻碍 9 型猪链球菌对 IPEC-J2 的粘附，对 2 型却没有影响，这其中的机制仍然是一片空白。Ferrando 等人于 2016 年提出了 SS2 粘附并侵入宿主肠上细胞的机制假说：SS2 通过其表面多个蛋白特异性结合肠上皮细胞表面特定受体，例如通过链球结合蛋白（SadP）特异性结合 Gb3/CD77 受体(Ferrando et al 2017)、文提及的多个 ECM 结合相关蛋白特异性结合胞外基质；通过支链淀粉酶（ApuA结合宿主食物中淀粉等葡聚糖为细菌增殖提供能量(Ferrando et al 2010)；依靠 Sly 透明质酸酶（Hyl）协作，降解 ECM 并形成孔洞，从而侵入血液循环并进一步传(Wu et al 2010)。在粘附侵入过程中，S. suis 还依靠 IgA1 水解酶、丝氨酸蛋白酶（SspA）、分泌性核酸酶（SsnA）来抵御宿主粘膜免疫系统，包括降解 IgA1、白胞介素-8（IL-8）以及中性粒细胞诱捕网(de Buhr et al 2014; Zhao et al 2016; Li M et2017)。目前 Schultsz 课题组正在针对这一假说展开研究，并取得了一定的进展(Ferrando et al 2017)。

图 2-1：表达质粒 pET-28a 图谱Figure2-1: The map for pET-28a vector表达与纯化试验油菌保存：将测序正确的重构质粒转化到 E.coli BL21（平板，37℃培养 12-14 h，挑取单菌落接于 3 ml 相应抗性℃，220r/min 振荡培养 8-14 h。取 500 μ l 菌液和 500 μ 管，混匀后保存于-80℃冰箱；菌：剩余的菌液以 1:100 的比例接入 5ml 含相应抗性的 L20 r/min 振荡培养到 O D600 达到 0.6 时，加入终浓度为 20

猪链球菌致 STSLS 相关转录因子的筛选及其调控机制的研究力的对策之一。为了评价各转录因子在宿主体内诱导后的表达情况，本研SS2 感染其天然宿主猪及常用动物模型小鼠，分离体内细菌并提取 RNA，-PCR 检测各转录因子在宿主体内转录水平。结果显示，不论在小鼠还是猪体内，除 SSU05_0937 略微下调以外，其余不同程度上调（如图 2-2B 所示），其中 SSU05_0930 差异最显著。这一结些基因可能在猪链球菌侵入宿主过程中扮演着重要的角色。
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本文编号：2835099