脯氨酸参与调控环江香猪胎儿发育分子机理的初步研究

发布时间：2020-10-12 16:00

　　 脯氨酸为环状α-亚氨基酸,在蛋白合成、机体的新陈代谢、伤口愈合、抗氧化及免疫反应均发挥着重要的调控作用。研究发现外源性添加适量的脯氨酸,可以促进胚胎、胎盘和孕体的生长发育,预防胎儿宫内生长迟缓(intrauterine fetal growth retardation,IUGR),并且在新生儿发育的初期阶段作为一种条件性必需氨基酸发挥重要作用。本研究拟探讨脯氨酸影响胎儿发育及胎盘细胞增殖的分子机理,以便为应用脯氨酸提高母猪的繁殖性能提供理论依据。首先,探讨了在环江香猪日粮中添加1%脯氨酸对妊娠70日龄胎儿和胎盘发育及相关指标的影响。结果显示:脯氨酸试验组的平均胎儿为122.07±29.43g,显著高于对照组(96.06±11.62g,P0.05)。脯氨酸试验组的平均妊娠胎儿数为7.87±0.35个,与对照组的6.87±0.40个相比略有增加,但差异不显著(P0.05)。脯氨酸试验组的胎盘组织糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)含量为20.34±0.24 ng/mL,空白对照组的为21.31±0.31 ng/mL,即脯氨酸显著下调了胎盘组织的GC含量(P0.05)。脯氨酸试验组的糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor,GR)mRNA相对表达量为0.67±0.02,空白对照组为1.10±0.01,说明脯氨酸组与空白对照组相比,GR mRNA相对表达量显著下降(P0.05)。试验组的GRα和GRβ蛋白的相对表达量分别为1.00±0.02和1.21±0.01,而对照组GRα和GRβ蛋白的相对表达量分别为1.02±0.03和1.11±0.01,即脯氨酸试验组和对照组的GRα和GRβ蛋白表达水平均无显著差异(P0.05)。在对猪表达的7种GR exon 1变体检测中,只发现GR exon 1-5和exon 1-9在环江香猪胎盘组织中有表达,且脯氨酸试验组中GRexon1-5的mRNA水平表达显著下调(P0.05),而GRexon1-9的表达水平差异不显著(P0.05)。其次,以体外培养胎盘绒毛膜细胞(BeWo)为模型,初步探讨了脯氨酸调控胎盘细胞增殖和凋亡的分子机制。用添加不同浓度脯氨酸(0μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、7.5μg/mL、10μg/mL、12.5μg/mL 和 15μg/mL)的培养液培养 BeWo 细胞24h、48h和72h后,结果发现用添加2.5μg/mL和5μg/mL脯氨酸的培养液培养BeWo细胞48 h可显著促进细胞增殖并抑制细胞凋亡。采用此浓度和时间组合分析了脯氨酸对相关基因表达的影响。QRT-PCR分析结果显示:添加2.5μg/mL和5μg/mL的脯氨酸可显著提高BeWo细胞的周期蛋白依赖性激-4(cyclin-dependent kinase-4,CDK4)、氧化低密度脂蛋白受体(oxidized low density lipoprotein receptor-1,OLR1)和抗凋亡基因 B 淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bc12)的mRNA表达水平(P0.01),而对凋亡基因含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteine aspartate-specific protease-3,Caspase-3)和Bcl-2 相关X蛋白(Bcl-2 associated x protein,Bax)的表达无显著影响(P0.05)。此外,处理组的GRmRNA和蛋白的表达量均显著下调(P0.05),调控GR表达的转录因子特异性蛋白-1(Specificityprotein1,Sp1)和环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)的 mRNA 表达亦均显著下降(P0.05),而转录因子Sp1的负调控因子肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene,p53)mRNA 表达显著上调(P0.05)。添加 5μg/mL 脯氨酸对BeWo细胞的氨基酸转运蛋-5(Amino acid transporter-5,SLC7A5)和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的 mRNA 表达水平无显著影响(P0.05),但添加2.5μg/mL脯氨酸则显著上调BeWo细胞的SLC7A5和mTOR 表达水平(P0.05)。以上结果表明,脯氨酸可能是通过下调exon1-5mRNA的表达,抑制GR mRNA的转录,导致胎盘组织中的GC含量下降,从改善了环江香猪胎儿宫内生长迟缓的现象。脯氨酸促进胎盘绒毛膜细胞的增殖可能是通过下调转录因子Sp1和CREB mRNA的表达,上调Sp1的负反馈调节因子p53的表达,从而进一步抑制了 GR基因和GR蛋白的表达水平,进而引起了信号通路上mTOR和SLC7A5表达上调实现的。
【学位单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S828
【部分图文】：

３糖皮质激素作用机制图．??ｉｇ．?３?Ｔｈｅ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ?ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．??．４转录因子对ＧＲ转录水平的影响??．４．１?Ｓｐｌ对ＧＲ转录水平的影响??

增殖与凋亡等一系列细胞生理周期过程。当机体不受到外界应激的情况下，ｐ５３以一种非活??性的状态存在细胞质中，但当受到压力、环境等应激，它的非活性状态则转化为活性状态，??通过与特异性靶基因结合的激活来诱导其生物学作用。ＧＲ与Ｐ５３的负反馈调控如图３所示，??当ＧＣ进入细胞质内，激活与ＧＲ的结合位点，形成ＧＲ－ＧＣ复合物进入细胞核，激活ｐ５３，??相互抑制各自与靶基因结合的转录，同时也形成ＧＲ－ｐ５３复合物，通过ＭＤＭ２信号通路调控??该复合物蛋白的降解。此外，ｐ５３还可以通过抑制ｐ５３反应元件的选择特异性基因的表达来??调节细胞增殖或凋亡等生ｉ里活性。Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ＿等在海马上的研究表明，ｐ５３基因的表达增加．??会促使ＧＲ基因的表达下降，说明ｐ５３与ＧＲ存在着拮抗调节的关系。ｐ５３除了对ＧＲ转录水??平进行抑制外，还抑制ＧＲ的功能例如负反馈于下丘脑－垂体－肾上腺（ＨＰＡ）轴。ＭｕｒｐｈｙｌｌＭＩ??等研究发现ｐ５３蛋白通过ＧＣ削弱了炎症因子ＮＦ－ｋＢ目标基因的表达，而ｐ５３的损伤突变也??削弱糖皮质激素受体的转录靶基因。其他研宄小组报道

基于ＱＲＴ－ＰＣＲ定量引物的要求较为严格，因此在利用Ｏｌｉｇｏ?７．０并结合Ｐｒｉｍｅｒ?５．０软件，??严格按照设计引物的各参数要求，进行引物设计，之后利用在线网页ＮＣＢＩ工具进行Ｐｒｉｍｅｒ??ｂｌａｓｔ，检测引物的特异性，特异性良好之后才能合成。按
【参考文献】

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本文编号：2837988