MiR-3031通过靶基因POU2F3调控奶山羊乳腺发育的研究

发布时间：2020-10-12 22:40

　　 microRNAs是一类短的,高度保守的非编码RNA,可调节基因的表达。MiR-3031作为一个功能性miRNA,参与调节奶山羊乳腺发育和泌乳等多种重要的生物学过程。本试验旨在研究POU2F3和miR-3031在奶山羊乳腺上皮细胞中的靶向关系及其功能,为奶山羊乳腺发育和泌乳提供理论依据。通过RT-qPCR,Western blot和构建双荧光素酶报告载体验证miR-3031与POU2F3的靶向调节作用。生物信息学分析表明,POU2F3的3'UTR区包含miR-3031的结合位点。同时,miR-3031降低了PsiCHECKTM2-POU2F3 3'UTR-wt的双荧光素酶活性。RT-qPCR和Western blot结果显示,与对照组NC相比,miR-3031 mimics显著降低POU2F3的mRNA和蛋白水平的表达;结果表明POU2F3是miR-3031的靶基因。转染miR-3031 24h、48h后CCK8检测miR-3031对奶山羊乳腺上皮细胞活力的影响。结果显示,miR-3031 mimic显著提高奶山羊乳腺上皮细胞的活力。转染siPOU2F3 24h后EDU检测奶山羊乳腺上皮细胞增殖的情况,结果显示,干扰POU2F3显著促进奶山羊乳腺上皮细胞的增殖。将siPOU2F3和si-NC转染到乳腺上皮细胞中,进一步研究POU2F3对奶山羊乳腺上皮细胞凋亡的作用机理。流式结果表明,siPOU2F3显著抑制奶山羊乳腺上皮细胞凋亡。同时,siPOU2F3显著抑制Bcl-2和Bax蛋白的表达,上调Bcl-2/Bax的比率;同时,检测AKT和mTOR的磷酸化水平。结果表明,siPOU2F3显著上调了AKT、mTOR的磷酸化水平和PTEN的蛋白水平以及显著下调PI3K蛋白的表达。综上所述,miR-3031靶向POU2F3通过AKT/mTOR信号通路促进奶山羊乳腺上皮细胞增殖,抑制凋亡。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S827
【文章目录】：
ABSTRACT
摘要
Chapter 1 INTRODUCTION
    1.1 Literature Review
    1.2 Research progress on mammary gland development in dairy goats
        1.2.1 Mammary gland development and lactation mechanism
        1.2.2 Breast epithelial cells research progress
    1.3 miRNA and mammary gland development
        1.3.1 Mechanism action of miRNAs
        1.3.2 Identification methods of miRNA target genes
        1.3.3 Regulation of miRNAs on mammary gland development
        1.3.4 Regulation of miRNA on lactation function
    1.4 Research progress of RNA interference technology
    1.5 Research progress of POU2F3 gene
    1.6 Research Content
    1.7 Research Plan
Chapter Ⅱ:Study on the Regulation of POU2F3 Gene by miR-3031
    1.8 Introduction
    1.9 Materials and methods
        1.9.1 Sample Collection
        1.9.2 Main equipment
        1.9.3 Main test reagents
        1.9.4 Prediction of miR-3031 target POU2F3 gene
        1.9.5 Construction of dual luciferase reporter vectors and mutant vectors
        1.9.6 Chemical synthesis of miRNA mimics
        1.9.7 293T cell co-transfection and luciferase activity assay
        1.9.8 Dairy goat mammary epithelial cell transfection
        1.9.9 Real time-qPCR
        1.9.10 Western blotting
        1.9.11 Western blot detection
        1.9.12 Statistical analysis of data
    1.10 Analysis of results
        1.10.1 Bio information prediction of miR-3031 target gene
        1.10.2 Cloning of the POU2F3-3'UTR region
        1.10.3 Construction of dual luciferase reporter vector
        1.10.4 Detection and analysis of luciferase activity
        1.10.5 Effect of miR-3031 on the m RNA level of POU2F3 gene
        1.10.6 Effect of miR-3031 on POU2F3 gene at protein level
        1.10.7 CCK8 method for detecting cell proliferation
        1.10.8 Discussion
    Summary
Chapter Ⅲ:Study on the Regulation of POU2F3 on Mammary Epithelial Cells in Dairy Goats..
    1.11 Introduction
    1.12 Materials and methods
        1.12.1 Collection of samples
        1.12.2 Main equipment
        1.12.3 Main test reagents
        1.12.4 Flow cytometry to detect apoptosis
        1.12.5 Edu incorporation assay
        1.12.6 Statistical Analysis
    1.13 Analysis of results
        1.13.1 POU2F3 Interference Efficiency Detection
        1.13.2 Apoptotic effect of miR-3031 on mammary epithelial cells
        1.13.3 Effect of POU2F3 interference on apoptosis genes in mammary epithelial cells
        1.13.4 Edu incorporation assay
        1.13.5 Effect of POU2F3 interference on P-m TOR/mTOR signaling pathway
        1.13.6 Effect of POU2F3 interference on PTEN synthesis in mammary epithelial cells
    1.14 Discussion
        1.14.1 Effect of POU2f3 on proliferation and apoptosis of mammary epithelial cells in dairy goats
        1.14.2 Regulation of POU2F3 on the lactation component of mammary gland epithelial cells in dairy goats
    Summary
CONCLUSION
INNOVATION
REFERENCE
ARTICLE
ACKNOWLEDGEMENT
APPENDIX
ABBREVIATION
PERSONAL STATEMENT

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本文编号：2838382