鸭疫里默氏菌对利福平的耐药机制初探及rpoB基因突变的适应性研究

发布时间：2020-10-13 08:49

　　 鸭疫里默氏菌(RA)是一种可以感染鸭、鹅、火鸡和其它禽类的细菌性病原体。近年来RA对抗生素利福平的耐药情况日益严重。围绕RA耐利福平机制及RA rpoB基因的突变对其生存和适应性的影响,开展的主要研究内容和结果如下:1.鸭疫里默氏菌利福平耐药机制的研究对110株RA进行利福平MIC测定,89%(98/110)RA对利福平具有耐药性,MIC值在0.5~256μg/mL之间。对18株RA rpoB序列与MIC关联性进行分析、利用定点突变和自然转化技术构建过表达菌株进行验证,结果表明RA rpoB基因5个氨基酸位点的突变(V382I、H491N、R494K、G502K和S539Y)与利福平耐药相关。试验发现RA-CH-1株和RCAD0147株具有相同的rpoB突变,但对利福平MIC却相差8倍,分别是32μg/mL和256μg/mL。利用外排泵抑制剂羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)和维拉帕米(VP)进行试验,发现RCAD0147编码有与利福平耐药相关的药物外排泵,它与rpoB突变两种机制共同提高RCAD0147对利福平的耐药水平。2.rpoB突变对RA适应性代价的研究利用RA自发突变试验分离到了15种类型的rpoB突变株,其中R494K与分离株中检测到的突变类型完全一致。经菌落平板计数计算得出rpoB基因突变频率约为10~(-8),所得突变株中98.8%(247/250)位于rpoB基因利福平耐药决定区簇I。除D481Y、I537N和S539F外,其余突变株对利福平MIC至少达到了64μg/mL。位点H491D和484::TAA的突变导致RA出现生长延迟。体外竞争性试验结果显示突变株适应性降低,且位点H491D和484::TAA突变株影响最大(相对适应性分别是0.60和0.63)。最后对R494K和H491D突变株的定殖能力和敏感性进行测定,结果与亲本株相比两突变株对H_2O_2和SNP的敏感性均上升。体内定殖试验表明,24h内两突变株在感染5日龄雏鸭的气管和脑中定殖的活菌数明显降低。该研究表明RA对利福平耐药的突变株中,rpoB基因单突变导致RA适应性减弱,产生了适应性代价。
【学位单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.61
【部分图文】：

需要在稀释好的菌液中添加次抑制浓度（1/2 抑制浓度排泵抑制剂 VP 对 RA 的生长不存在明显的抑制作用，在测 MIC 时，需要在稀释好的菌液中添加适当浓度（80 μg/mL骤参见第二章“2.1 110 株 RA 对利福平耐药性测定”。最终[91]所述，对利福平的 MIC 值至少降低为原来的 1/4 才能被。果 RA 对利福平耐药性测定结果

RCAD0127 中同时存在 G50有 R494K 突变的菌株则表现H-1 和 RCAD0147 两个菌株上表现出至少 8 倍的差异。3:: rpoB+过表达菌株的与 pLMF03 空白质粒模板，利用所设计引物，B 基因全长为 3828 bp，附带存在大肠杆菌 DH5α 中。将盒抽提质粒（图 2-2）。

图 2-3. pLMF03::rpoB＋质粒双酶切鉴定Figure 2-3. Identification of pLMF03::rpoB+ plasmids by double enzyme digestion泳道 M 为 DL15000 Marker；泳道 1 为 pLMF03::rpoB(V382I)质粒；泳道 2 为pLMF03::rpoB(H491N) 质粒；泳道 3 为 pLMF03::rpoB(R494K) 质粒；泳道 4 为pLMF03::rpoB(G502K) 质粒；泳道 5 为 pLMF03::rpoB(S539Y) 质粒；泳道 6 为pLMF03::rpoB(V382I)双酶切产物；泳道 7 为 pLMF03::rpoB(H491N)双酶切产物；泳道 8 为pLMF03::rpoB(R494K)双酶切产物；泳道 9 为 pLMF03::rpoB(G502K)双酶切产物；泳道 10 为pLMF03::rpoB(S539Y)双酶切产物；Lane M is DL15000 Marker; Lane 1 is pLMF03:: rpoB (V382I) plasmid; Lane 2 is pLMF03::rpoB (H491N) plasmid; Lane 3 is pLMF03:: rpoB (R494K) plasmid; Lane 4 is pLMF03 :: rpoB(G502K) plasmid; Lane 5 is pLMF03:: rpoB (S539Y) plasmid; Lane 6 is pLMF03:: rpoB (V382I)double digested product; Lane 7 is pLMF03:: rpoB (H491N) double digested product; Lane 8 ispLMF03:: rpoB (R494K) double digested product; Lane 9 is pLMF03 :: rpoB (G502K) double digestionproduct; Lane 10 is pLMF03:: rpoB (S539Y) double digestion products3.3.3 RpoB 过表达菌株 ATCC 11845-pLMF03::rpoB＋的鉴定
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本文编号：2838967