鸡β-防御素Gal-4基因的原核表达及重组蛋白抑菌活性检测

发布时间：2020-10-14 01:43

　　 防御素是伴随着人们对抗生素毒副作用的逐渐认识而发展起来的,许多防御素对细菌、真菌、病毒等均具有抑制作用,不易产生耐药性,稳定性良好,可制成新型抗菌药物或用于饲料添加剂和食品防腐剂等。目前对禽类β-防御素的研究比较热门,许多鸡β-防御素已被克隆和表达,并且通常具有抗菌活性,但对鸡β-防御素Gal-4基因的克隆和表达的研究未见报道,笔者利用基因工程技术,获得了Gal-4的重组蛋白,并对其抑菌活性进行鉴定,最后利用这种蛋白进行了细菌感染小鼠的预防及治疗研究。为开发新型的抗菌药物做出了一定贡献,为筛选和鉴定具有良好生物活性的防御素提供了实验基础,为Gal-4在兽医临床中的应用提供了很好的实验依据。主要研究内容与结果如下:从鸡骨髓中提取总RNA,反转录合成cDNA,设计特异性引物扩增鸡β-防御素Gal-4成熟肽区基因,将目的基因克隆到原核表达载体pET-30a的BamHI和HindIII双酶切位点上,构建原核表达载体pET-30a-Gal-4,转化于大肠杆菌BL21感受态细胞中,菌液经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE与Western blotting检测,并对重组蛋白进行Ni柱亲和层析纯化与脱盐浓缩处理。结果表明,成功扩增了大小为148 bp的目的基因,并构建了原核表达载体pET-30a-Gal-4,经诱导表达后可检测到大小在14 kDa左右的目的蛋白。经纯化后得到浓度为0.8 mg/mL的重组蛋白,SDS-PAGE显示在14 kDa左右出现了清晰的目的条带。为了鉴定重组蛋白Gal-4的体外抑菌活性,使用金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌进行了初步研究,试验采用打孔法和细菌生长曲线法鉴定重组蛋白Gal-4对金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌的抑菌活性。结果表明,重组蛋白Gal-4对金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌均出现了良好的抑菌效果。把重组蛋白Gal-4作为一种新型抗菌药物,用于预防和治疗金黄色葡萄球菌感染小鼠模型,结果发现重组蛋白Gal-4在小鼠体内发挥了良好的杀菌作用,起到了一定的预防和治疗动物疾病的效果。
【学位单位】：塔里木大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.4
【部分图文】：

图 2-1 Gal-4 成熟肽区基因 PCR 扩增结果：DL2000 DNA Maker；1-2：Gal-4 成熟肽区基PCR amplification results of Gal-4 mature peptide rL2000 DNAMaker；1-2：Gal-4 mature peptide reg

重组质粒pET-30a-Gal-4的菌液PCR鉴定

图 2-3pET-30a-Gal-4 重组蛋白 SDS-PAGE 检测Fig. 2-3 detection of pET-30a-Gal-4 histone SDS-PAGE1：蛋白 Maker；2：空质粒大肠杆菌；3-9：分别为终浓度 0 mM、0.25 mM0.5 mM、0.75mM、1 mM、1.25 mM、1.5 mM 的 IPTG 进行诱导 8 h 的结果。
【参考文献】

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本文编号：2839993