禽致病性大肠杆菌O1、O2、O78型多重PCR检测方法的建立及应用

发布时间：2020-10-14 14:27

　　 禽致病性大肠杆菌是制约养禽业发展的重要病原之一,其O-抗原血清型具有高度复杂性,不同地区甚至同一地区的不同养禽场优势血清型不尽相同,根据不同血清型制作的疫苗之间不具备交叉保护力。但对同一养殖场而言,其致病性大肠杆菌的血清型在几年内是相对稳定的,所以对不同地区养禽场致病性大肠杆菌进行血清型流行病学调查,根据其优势血清型制备相应疫苗是防治禽大肠杆菌病的有效措施之一。本研究根据不同血清型大肠杆菌O-抗原合成基因簇具有特异性的特点,以O-抗原基因簇中的寡糖单位翻转酶基因(wzx)为靶基因,建立了检测禽致病性大肠杆菌O1、O2、O78型的多重PCR方法。并优化了引物浓度、Taq聚合酶浓度、10×Buffer用量、退火温度、退火时间延伸温度和延伸时间这几个影响多重PCR扩增效果的关键因素。优化后的多重PCR扩增体系为DNA模板,1μL;10×Ex Taq Buffer(Mg~(2+)Plus 20mM),2.5μL;dNTP Mixture(各2.5mM),2.5μL;Ex Taq酶(5U/μL),0.3μL;上下游引物(10pmol),各0.5μL;加灭菌双蒸馏水补足至25μL。多重PCR扩增参数为95℃预变性5min,94℃变性30s,59℃退火1.5min,72℃延伸1min,共进行30个循环,最后72℃延伸10min。DNA最低检出浓度为100pg/μL,并具有特异性。应用所建立的多重PCR方法检测了54株APEC长春分离株的血清型,以验证所建立的多重PCR方法的稳定性及实用性。结果显示,54株APEC长春分离株中O1型检出率为9.26%(5/54),O2型检出率为7.41%(4/54),O78型检出率为40.74%,O1、O2、O78型总体检出率为57.41%(31/54)。为了评价多重PCR检测方法的效果,使用传统血清凝集法检测54株APEC长春分离株的血清型,结果显示两种方法的符合率达85.19%(46/54),证明多重PCR检测方法具有良好的检测效果。
【学位单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.61
【部分图文】：

图 3.1 单重 PCR 扩增结果adder K；1、2：E.coli O1（CVCC249）；3、4：5、6：E.coli O78（CVCC1555）Fig 3.1 PCR amplification results2：E.coli O1（CVCC249）；3、4：E.coli OE.coli O78（CVCC1555）与同源性比较 wzx 基因 PCR 产物测序与同源性比较CVCC249）的 DNA 为模板，按预实验zx 基因，将 PCR 产物回收纯化后，送至结果呈递 BLAST 系统作同源性分析，

图 3.2 引物浓度对多重a：E.coli O1（CVCC249）；b：E.coli O2（M：DNA 分子量标准 Ladder K；1-6 分别表示Fig 3.2 Effect of primer concentraa：E.coli O1（CVCC249）；b：E.coli O2（M：DNA Ladder K；1-6 indicate the concentratirespe3.3.2 Ex Taq 酶浓度的优化在筛选出最佳引物浓度的基础上，3.3 所示，当 Ex Taq 酶量为 5U、4U 和异性条带。当 Ex Taq 酶量为 1.5U 时，以增反应均较清晰的目的条带，且有较少果较好。所以选取 1.5U 进行后续实验。（c）E.coli O78

图 3.3 Ex Taq 酶浓度对多a：E.coli O1（CVCC249）；b：E.coli O2（M：DNA 分子量标准 Ladder K；1-5 分别表Fig 3.3 Effect of Ex Taq enzymM：DNA Ladder K；1-5 indicate the quantity respe3.3.3 10×Ex Taq Buffer 量的优化在上述最佳引物浓度、最佳酶浓度Taq Buffer 的用量，以探究最佳用量。从2.5μL 时，多重 PCR 出现非特异性扩增拖带情况出现。所以选取 2.5μL 进行后（c）E.coli O78
【参考文献】

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本文编号：2840787