鸭感染肠炎沙门氏菌应答基因的作用及对产蛋性能的影响

发布时间：2020-10-14 23:03

　　 肠炎沙门氏菌(Sallmonellaenteritidis,SE)常定植于成年家禽生殖道的卵巢等组织,造成禽蛋的直接污染和垂直传播难于清除和预防,不仅影响了产蛋量,还造成禽蛋和环境污染,危害人类健康。卵巢和输卵管的抗菌作用对于禽蛋免受感染以及产生卫生蛋是必需的,鉴于SE感染鸭生殖道过程中,宿主的应答反应及关键分子的调控机制尚不清楚。本研究以高产蛋鸭绍鸭为研究对象,构建人工感染模型,通过RNA-seq转录组测序技术和酵母双杂交系统筛选鸭感染SE的应答基因,并探讨了关键基因PERP在调控SE感染鸭卵泡颗粒细胞(duckgranulosacell,dGC)凋亡中的作用机制,研究结果为揭示SE的致病机理及宿主抗病机制奠定基础,同时为提高禽蛋食品安全性提供一定的参考依据。主要研究结果如下:1.SE人工感染鸭生殖道的动态分布及部分免疫指标检测构建SE人工感染模型,利用特异性PCR和免疫组化检测了 SE组织分布,系统监测了感染后1-13周的粪便带菌率。结果显示,SE感染鸭大多数呈隐性感染状态,致死率不高,但长期间歇性对外排毒,性成熟后细菌扩散至生殖道,并根据1-13周粪便带菌率结合生殖道剖检病变,将感染鸭分为易感组和不易感组,易感鸭卵巢基质、小卵泡、输卵管峡部和阴道载菌量分别为 5.04 log CFU/g、3.57 log CFU/g、4.92 log CFU/g 和 5.74 log CFU/g。同时,采用ELISA法检测了 SE感染后鸭血清中免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)、T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+)和生殖激素(PROG、E2、LH、FSH)水平,结果表明,易感组鸭IgA、IgG、IgM水平显著高于不易感组(P0.05),而CD3+、CD4+、CD8+含量呈现出相反趋势;易感组鸭PROG、E2、LH、FSH水平显著低于不易感组(P0.05)。进一步采用RT-qPCR检测了感染13周后对细菌定植组织进行免疫应答基因表达谱。结果表明,SE 感染后,Tolls 样受体(TLR2、TLR4-5、TLR15、TLR21)、NODs 样受体(NOD1、NLRX1、NLRP12)、禽类β-防御素(AvβD4-5、AvβD7、AvβD12)、细胞因子(IL-6、IL-1β、IFN-γ)和MyD88在卵巢基质、小卵泡、输卵管峡部和阴道等组织显著上调(P0.05);而TLR3、TLR7、NLRC3和TNF-α在上述组织中显著下调(P0.05)。上述结果表明,SE感染导致鸭机体产生了强烈的免疫应答反应。此外,检测了 SE感染后鸭产蛋性能和蛋品质。结果显示,SE感染后,开产推迟,易感组24周产蛋率仅为67.14%,显著低于不易感组(92.86%)和对照组(98.57%),同时SE感染后,蛋重、蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋白高度和蛋黄颜色等指标显著下降(P0.05)。由上可以看出,SE感染对蛋鸭产蛋量、蛋品质都产生了较大的影响。2.基于RNA-seq筛选SE感染鸭卵巢的应答基因为揭示鸭SE感染宿主生殖道应答机制,在上述建立鸭SE卵巢感染模型的基础上,通过RNA-Seq高通量测序技术,分析了 SE感染前后卵巢组织(小卵泡、卵巢基质)差异表达基因。结果表明,小卵泡和卵巢基质组织分别筛选出915和1203个差异基因,其中PERP、EGFR、PAFAH1B2、DOK6、RXFP2等23个基因为共同差异表达基因,KEGG富集分析表明,差异基因主要富集在细胞凋亡相关通路p53信号通路。并采用RT-qPCR验证部分差异基因,发现其表达趋势与转录组测序结果均一致。该结果筛选出的鸭卵巢SE感染应答基因,为进一步研究SE的卵巢致病机理奠定了基础。3.PERP在SE感染鸭卵泡颗粒细胞致凋亡作用研究以关键候选应答基因PERP为研究对象,以鸭卵泡颗粒细胞为模型,通过干扰和过表达手段,分析其在SE感染dGC中的作用。结果表明,SE感染dGC,经PERP过表达后,p53信号通路关键分子p53、MDM2、PERP以及caspace-3和Bcl-2在mRNA和蛋白水平表达上调(P0.01);PERP敲低后,表现出相反趋势。同时采用CCK8和FACS分别检测了过表达和敲低PERP颗粒细胞增殖与凋亡水平,发现过表达PERP促进dGC凋亡,敲低PERP促进dGC增殖(P0.01)。进一步采用平板计数法检测过表达和敲低PERP后dGC的SE黏附和侵袭量,发现过表达PERP,SE对dGC的黏附和侵袭能力显著增强,而敲低PERP,则减少SE对dGC的黏附和侵袭量(P0.01)。上述结果提示PERP可介导p53信号传导途径调控SE感染dGC致凋亡作用。4.PERP蛋白与肠炎沙门氏菌SipC蛋白相互作用为进一步揭示PERP蛋白体外参与SE感染dGC的作用,利用Gateway技术,以鸭肠炎沙门氏菌MY1 SipC蛋白(SE感染中的分泌到宿主细胞的效应蛋白)作为“诱饵”,通过GAL4酵母双杂交系统从dGC cDNA文库中筛选到12个与SipC蛋白相互作用蛋白,其中PERP的阳性克隆出现频率高、速度快,表明PERP与肠炎沙门氏菌SipC效应蛋白发生互相作用。采用一对一酵母回复性杂交和GST-pull down试验进一步验证SipC与PERP相互作用关系,且利用λRed同源重组系统构建sipC基因缺失株,体外证实过表达PERP可以促进SE MY1 SipC黏附鸭卵泡颗粒细胞。综上所述,SE感染后,不仅引起鸭卵巢基质、小卵泡、输卵管峡部和阴道等组织免疫应答反应,还影响产蛋性能和蛋品质。感染中关键应答基因PERP可介导p53信号传导途径参与dGC凋亡,并与SE SipC蛋白相互作用,促进细菌侵袭。本研究结果为揭示SE的致病机理及宿主抗病机制提供参考,也为后续的抗病分子育种奠定了理论基础。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S858.32
【部分图文】：

１３?１４?１５?１６?１７?１８?１９?２０?２１?２２?２３?２４?２５?２６?２７??Ａｇｅ（ｖｖｋ）??图１－２试验期间蛋鸭粪便排毒带菌分析??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ?ｏｆ?ＳＥ－ｐｏｓ

３７°Ｃ培养２４ｈ后再加入９ｍＬ?ＳＣ选择性增菌液，３７°Ｃ培养２４ｈ后用热裂解法制备模板。进??行扩增。发现易感组鸭的小卵泡、卵巢基质、峡部、阴道增菌液较浑浊，扩增后出现??预期的２９３ｂｐ大小的条带（图１－５），其他组织未出现条带；不易感组和对照组所有组织均??未扩增出条带。取５０ｐＬ的组织匀浆，涂布在ＤＨＬ平板上，３７°Ｃ培养２４ｈ后，与ＰＣＲ检??测结果一致，小卵泡、卵巢基质、峡部、阴道组织匀浆液出现了单个菌落。大卵泡、漏斗??部、膨大部、子宫组织匀浆液未出现菌落，通过ＳＥ组织载菌量（ＣＦＵ）评估，卵巢基质??中细菌定植最高

?Ｍｌ?２３４?５?６７８９?１０?１１??图１－５感染ＳＥ生殖道不同组织增菌液．《仍基因ＰＣＲ鉴定??Ｆｉｇｕｒｅ?１－５?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＳＥ?ｓｔｒａｉｎｓ?ｉｓｏｌａｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｆｏｌｌｉｃｌｅ
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本文编号：2841319