PDGF-BB和EGF对山羊SSCs体外增殖的影响

发布时间：2020-10-16 00:17

　　 精原干细胞(SSCs)是一种特殊的、也是唯一能够将雄性哺乳动物的遗传物质遗传给子代的二倍体细胞。目前,SSCs已被应用于转基因动物的生产、男性不育症的治疗等领域。然而,SSCs的体外培养技术尚不完善,与SSCs增殖有关的通路和机制尚不明确。为了研究表皮生长因子(EGF)和血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)对山羊SSCs体外增殖的影响,本研究将60-75日龄的山羊睾丸(n=6)剪碎后,利用两步酶消化法得到睾丸单细胞悬液,然后通过两次差速贴壁法分离纯化山羊SSCs,采用碱性磷酸酶染色法及免疫荧光染色法鉴定山羊SSCs。随后,单独添加不同浓度的EGF和PDGF-BB,并联合添加EGF和PDGF-BB培养山羊SSCs。利用甲基噻唑基四唑(MTT)法分别检测SSCs培养3天,6天和9天后的吸光度,筛选最佳单独添加浓度和配伍添加浓度;然后,利用western blotting检测空白对照组及3个最佳浓度试验组中的ERK1/2蛋白和磷酸化ERK1/2蛋白的表达量,运用real time PCR技术检测空白对照组及3个最佳浓度试验组中BAD、BCL2和BAX基因的相对表达量;最后,添加MEK1/2的特异性抑制剂PD0325901后,再次检测空白对照组及3个最佳浓度试验组中的ERK1/2蛋白、磷酸化ERK1/2蛋白、BAD、BCL2和BAX基因的表达量。主要研究结果如下:1.睾丸单细胞悬液经两次差速贴壁纯化后,能够获得纯度较高的SSCs。染色结果显示,纯化后的细胞经钙钴法碱性磷酸酶染色后呈AKP阳性,SSCs被染色成黑色;免疫荧光染色结果表明,纯化后的细胞大量表达SSCs的标记分子THY1和PLZF。2.与对照组相比,单独添加25 ng/mL EGF或35 ng/mL EGF均可以显著促进山羊SSCs的自我更新(P0.05),但两者之间差异不显著(P0.05);单独添加20 ng/mL的PDGF-BB的效果最佳(P0.05);同时添加25 ng/mL的EGF和20 ng/mL的PDGF-BB对山羊SSCs的增殖效果显著高于其他组合(P0.05),培养6 d后,其OD_(490)为0.736。3.Western blotting结果显示:与对照组相比,3个最佳试验组的ERK1/2蛋白的表达均有不同程度的升高,其中联合添加20 ng/mL PDGF-BB+25 ng/mL EGF处理组的增幅最大,单独添加20 ng/mL的PDGF-BB处理组变化最小;添加MEK1/2的特异性抑制剂后,4个处理组的ERK1/2蛋白的表达水平均降低,但3个试验组的变化幅度小于对照组。对照组的磷酸化ERK1/2蛋白的表达量均明显低于其他3个试验组,后者大约是前者的3~5倍;添加特异性抑制剂后,4个处理组的磷酸化ERK1/2蛋白的表达量降低至原先的10%~30%。4.real time PCR结果表明:与对照组相比,3个试验组的BCL2基因表达量均上调。其中,联合添加20 ng/mL PDGF-BB+25 ng/mL EGF处理组的细胞抗凋亡能力显著高于其他组(P0.05),25 ng/mL EGF组的BCL2表达水平显著高于对照组(P0.05),然而20 ng/mL PDGF-BB组中的抗凋亡基因BCL2表达水平与对照组相比差异不显著(P0.05);与其他所有试验组相比,对照组的促凋亡基因BAX和BAD的表达水平显著升高(P0.05),而试验组之间差异均不显著(P0.05)。添加PD0325901后,所有处理组中的抗凋亡基因BCL2的表达量极显著降低(P0.001),仅为原先的10%~20%,而BAX和BAD表达水平极显著升高(P0.001)。结论:单独或联合添加EGF和PDGF均有利于促进山羊SSCs的自我更新,我们推测这两种生长因子可能是通过Ras/ERK1/2信号通路来调控山羊SSCs磷酸化ERK1/2蛋白的表达,进而提高SSCs的抗凋亡能力。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S827
【部分图文】：

图 1-1 SSCs 自我更新和分化示意图（Komeya and Ogawa 2015）注：实心箭头虚心剪头表示 SSCs 分化，虚心剪头表示 SSCs 自我更新。Fig.1-1 Schematic view of self renewal and differentiation of SSCs (Komeya and Ogawa 2015).Note: Solid and broken arrows indicate differentiation and self renewal, respectively.哺乳动物精子发生起始于性原细胞（gonocytes）向SSCs的转化，然而由于物种特异性的不同，精子发生的起始时间因物种的不同而有所差异。啮齿类动物的精子发生一般起始于出生后5~7 d（5~7 day post partum，5~7 dpp），家畜通常需要数月才能完成由性原细胞向SSCs的转化，如猪的精子发生常起始于出生后2~3个月（Zheng et al. 2014b），而人类则需要在出生后10~13年才开始进行精子发生（Dym et al. 2009）。1.2 精原干细胞的分离与富集1.2.1 精原干细胞的分离一般来说，睾丸中的 SSCs 的数量极少，有研究发现啮齿类动物睾丸中的 SSCs 大约占其总的生殖细胞数的 0.02%~0.03%，约占总精原细胞数的 1.25%，大约只有 10.6%的未分化的精原细胞属于 SSCs，小鼠的每个睾丸中大约有 35000 个 SSCs（Meistrich and

步骤见附件Ⅲ。 结果与分析.1 睾丸单细胞悬液利用机械分离结合两步酶消化法可以获得山羊睾丸单细胞悬液。此时，悬液中类繁多，细胞形态、大小不均一，SSCs 纯度较低（见图 2-1A）。.2 山羊精原干细胞的纯化经差速贴壁纯化后，从睾丸单细胞悬液中获得纯度较高的 SSCs，纯化后的细胞卵圆形，其细胞大小基本均匀一致（见图 2-1 B）。

大小基本均匀一致（见图 2-1 B）。法纯化山羊精原干细胞。（A）差速贴壁前，即睾丸单壁后。Scale bar=400 μm。n of goat SSCs using differential plating. (A) before diffee single cell suspension; (B) after differential plating. Scal胞的鉴定碱性磷酸酶（AKP）染色表明，体外培养 10 d 后，SSCs 出现小的细胞克状沉淀（图 2-2）。
【参考文献】

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本文编号：2842454