通城猪和大白猪PRRSV感染前后外周免疫器官中差异表达LncRNA的鉴定与功能研究

发布时间：2020-10-16 04:56

　　 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是一种引起以母猪的繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病为典型特征的免疫抑制性疾病。1987年猪繁殖呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)在美国被首次发现,短短数年PRRS疫情席卷全球,造成了巨大经济损失。PRRSV基因组易变异,且具有免疫逃逸能力。兽医临床虽然通过各种措施进行防控,但效果不佳,PRRS抗病育种成为解决PRRS问题的重要出路。本课题组前期研究发现通城猪对PRRS具有较强的抗病性,针对通城猪的抗病性已经进行了转录组、蛋白组和与微小RNA(MicroRNA,miRNA)水平的研究,发现了大量的差异表达mRNA和miRNA。近年来发现长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)在抗病毒免疫过程中扮演了重要的调控角色,LncRNA可以通过调控mRNA或者miRNA来影响病毒的增殖。本研究拟对通城猪和大白猪,PRRSV人工感染前后的脾脏和腹股沟淋巴结中差异表达LncRNA进行研究,为揭示LncRNA在宿主抗PRRSV免疫应答中发挥的作用和PRRSV的抗病育种奠定基础。取得的主要结果如下:1.通城猪和大白猪PRRSV感染前后,脾脏和腹股沟淋巴结中LncRNA差异表达分析以通城猪和大白猪PRRSV人工感染前后的脾脏和腹股沟淋巴结的RNA-seq数据为材料,通过使用FastQC、Tophat2、Cufflinks系列软件与LncRNA转录本筛选和差异表达分析流程,进行了通城猪和大白猪PRRSV感染前后脾脏与腹股沟淋巴结中LncRNA的鉴定与差异表达分析。发现PRRSV感染后均引起通城猪和大白猪LncRNA差异表达。在脾脏中,鉴定出通城猪感染后差异表达LncRNA 441条,鉴定出大白猪感染后差异表达LncRNA 695条,同时两品种脾脏中本底表达LncRNA有1744条呈现出品种间遗传差异;在腹股沟淋巴结中,鉴定出通城猪感染后差异表达LncRNA1602条,鉴定出大白猪感染后差异表达LncRNA 777条,同时两品种腹股沟淋巴结中本底表达LncRNA有282条呈现出品种间遗传差异。2.参与PRRSV免疫应答和抗病毒通路调控的LncRNA的筛选对上述分析得到的PRRSV感染后差异表达LncRNA,通过三种途径来筛选参与宿主对PRRSV免疫应答的候选LncRNA。第一种途径,使用权重基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)构建PRRSV感染后差异表达LncRNA与差异表达mRNA的共表达网络和模块,导入病毒载量信息,关注PRRSV免疫应答关键模块中与病毒载量相关性高的LncRNA。通过这种筛选共得到59条候选LncRNA;第二种途径,聚焦PRRSV感染后差异表达倍数排前10%的极端差异LncRNA,选出通城猪与大白猪脾脏和腹股沟淋巴结中PRRSV感染后极端差异LncRNA共109条;第三种途径,根据文献中报道参与PRRSV免疫应答的基因与miRNA,反向逆推与之相关的LncRNA。通过这种筛选得到了4条与PRRSV免疫应答相关基因共定位的LncRNA,71条与PRRSV免疫应答相关miRNA有结合位点的LncRNA。通过对候选LncRNA分析发现,三种不同途径均可筛选出LncRNA ALDB4471。ALDB4471与抗PRRSV基因RSAD2重叠,并且表达量与病毒载量呈正相关,是PRRS相关关键模块中与病毒载量相关性排前10%的LncRNA,而且ALDB4471在通城猪和大白猪PRRSV感染后脾脏与腹股沟淋巴结中均极端上调。3.ALDB4471的功能研究通过RACE试验发现了RSAD2的未注释新转录本,命名为RSAD2?。ALDB4471与RSAD2?的3’末端重叠。构建ALDB4471真核表达载体,在细胞中超表达ALDB4471后进行PRRSV感染实验,发现,超表达ALDB4471可以显著抑制细胞中RSAD2的表达,并且显著促进PRRSV复制。为了研究ALDB4471与RSAD2的关系,使用Poly(I:C)诱导PK-15细胞中RSAD2的表达,然后超表达ALDB4471,发现ALDB4471可以显著抑制RSAD2的表达。通过RPIseq与catRAPID网站预测ALDB4471与蛋白质的结合情况发现,ALDB4471可以与转录因子p53结合,而且目前研究表明p53可以促进RSAD2的表达。所以提出猜想,ALDB4471可以通过与RSAD2竞争性结合转录因子p53,从而使RSAD2表达受到抑制。本研究主要完成了通城猪和大白猪感染PRRSV后脾脏与腹股沟淋巴结中LncRNA的鉴定与差异表达分析;通城猪与大白猪品种间差异表达LncRNA的鉴定与分析;参与PRRSV免疫应答的LncRNA的筛选与功能验证。这些研究使我们对通城猪和大白猪抗PRRSV免疫应答的LncRNA水平差异有了更深入的了解。同时发现了参与PRRSV免疫应答的LncRNA ALDB4471,为PRRSV的抗病育种提供了参考。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S858.28
【部分图文】：

细胞的杀菌能力，这在一定程度上解释了 PRRSV 为何n et al, 2013）。细胞（natural killer cell NK）是天然免疫系统中的重要染性病原体与自身恶性肿瘤细胞，NK 可以裂解被感染经被证明可以抑制 PRRSV 的复制（Bautista and MolitorSV 会抑制 NK 细胞的细胞毒活性，导致被感染细胞难以s 是在胸腺中发育的一种 T 淋巴细胞，与 T 细胞不同的呈递细胞（Aps）的抗原呈递（Piguet et al, 1999）。 T 有细胞毒活性，还可以分泌 IFN （Stepanova and Sinkora 感染会抑制 T Cells 分泌 IFN 。（图 1-1）简要概括了各的情况下发生的变化。

甚至在中和抗体产生之前，成年宿主的病毒血症已经康复，但是猪仔病毒血症还在持续。这种现象暗示了，病毒的清除也许是通过体液免疫以外的途径，可能是先天性免疫或者细胞免疫。宿主感染 PRRSV 后的适应性免疫主要以体液免疫产生的中和性抗体，细胞免疫效应 T 细胞（CTLs）为主。有研究表明无论是仔猪或者成年猪，感染 PRRSV 后约 4 周才能产生中和抗体，随着中和抗体的产生，病毒血症与组织病毒载量持续下降（图 1-2）（Lopez et al, 2007; Yoo et al, 2010）。中和抗体产生的推迟主要是由于PRRSV 的结构蛋白 Gp5 存在高频率的突变与糖基化现象，并且 Gp5 存在诱骗性的抗原表位，使免疫系统无法产生正确的中和抗体（Balasuriya and MacLachlan ，2004）遗憾的是对于 PRRSV 感染条件下 CTLs 的研究很少，有报道显示 CTLs 在 PRRSV感染的宿主中非常微弱（Costers et al, 2009）。因此对于 PRRSV 感染下的细胞免疫还需要更深入的研究。

图 1-3 LncRNA 分类与各种调控机制 （Salviano-Silva et al, 2018）Fig. 1-3 LncRNA classification and various regulatory mechanisms1.2.2.2 LncRNA 在宿主抗病毒免疫中的研究进展宿主抗病毒免疫中的起作用的 LncRNA 也被广泛报道，这些 LncRNA 可以参与转录因子激活，IFN 等细胞因子的产生和 ISGs 转录调节等过程（Ouyang et al, 2016）（图 1-4）。LncRNACMPK2 与 NRAV 都被证明可以抑制干扰素调节通路，干扰 ISGs的转录（Ouyang et al, 2014）。LncRNANEAT1 可以通过诱导 IL8 来促进多种抗病毒基因的表达，最终抑制 HIV 的蛋白质合成（Zhang et al, 2013;Imamura et al, 2014）。LncRNA NKILA 可以通过阻断 NF- B 抑制因子 I B 失活来抑制 NF- B 入核，使得NF- B 的下游免疫通路无法正常激活（Liu et al, 2015）。由此可见 LncRNA 在宿主抗病毒免疫中起到重要的调控作用，很多抗病毒 LncRNA 被当做生物学标记用于药物开发和疾病诊断。
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本文编号：2842792