猪圆环病毒2型Cap蛋白在CHO-K1细胞系中的真核表达及鉴定

发布时间：2020-10-16 12:22

　　 猪圆环病毒2型(PCV2)流行于世界各国猪群中,主要与断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、仔猪先天性震颤(CT)以及猪繁殖系统障碍等多种疾病密切相关,这些疾病被统称为猪圆环病毒相关疾病(PCVD),严重影响着世界养猪业的健康发展。目前,已知的猪圆环病毒包括三种,猪圆环病毒1型(PCV1)、2型(PCV2)和3型(PCV3)。其中,PCV2核衣壳蛋白Cap含有抗原中和表位,可产生针对PCV2的特异性抗体,是PCV2亚单位疫苗和血清诊断的主要目标蛋白,被大量应用于实际生产中。PCV2的抗体检测方法主要有ELISA、IPMA和IFA等,其中ELISA抗体检测方法具备操作简便,可同时检测大量样品等优点,得到科研机构和养殖场的普遍应用。本研究基于CHO-K1真核表达系统,构建重组质粒pEE12.4-PCV2-Cap,转染CHO-K1细胞,通过加压筛选,有限稀释,得到能够高效表达Cap蛋白的单克隆细胞株,并对该细胞株进行悬浮驯化、发酵、纯化,得到目的蛋白通过Western blot以及动物免疫实验验证其免疫原性。结果表明PCV2-Cap蛋白能够在CHO-K1细胞中稳定表达;发酵过程中活细胞密度高达6.0×10~6个/mL,细胞活力在80%以上,PCV2-Cap蛋白表达量约为370 mg/L;并通过Western blot验证和间接ELISA检测方法的建立,证明了该蛋白具备良好的免疫原性。本研究成功构建了表达PCV2-Cap蛋白的CHO-K1悬浮稳转细胞系,并初步建立了间接ELISA检测方法,为猪圆环病毒2型血清学检测方法的建立奠定了基础。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.651
【部分图文】：

图 2.1 Cap 目的片段 PCR 扩增.2.1Amplification of Cap target fragment. DL2000 Marker；1-2. Cap 目的片段；er；1-2. Production of Cap gene by PCR机挑取 12 个单菌落做菌液 PCR 鉴，为阳性克隆，如图 2.2 所示。

图 2.2 重组质粒菌液 PCR 鉴定Fig.2.2 PCR identification of bacterial solutionM. DL5000 Marker；1-12. 单菌落 PCR 结果；13.阴性对照M. DL5 000 Marker；1-12. PCR results of the single colonies；13. Negative control重组质粒经 HindIII 和 EcoRI 双酶切后，电泳显示两条带，分别为 pEE1载体（8262 bp）和目的条带（660 bp），与预期大小一致，如图 2.3 所示。测结果显示 Cap 基因序列正确。

图 2.2 重组质粒菌液 PCR 鉴定Fig.2.2 PCR identification of bacterial solution000 Marker；1-12. 单菌落 PCR 结果；13.阴性对照r；1-12. PCR results of the single colonies；13. NegI 和 EcoRI 双酶切后，电泳显示两条带，分条带（660 bp），与预期大小一致，如图 2正确。
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本文编号：2843248