DLP1调控线粒体动力学失衡在朊病毒疾病模型中的作用机制
发布时间：2020-10-16 18:17
版病毒病(Prion disease)又称传染性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathy),是一种渐进性、致死性的神经退行性人畜共患病,该疾病的主要病理学变化为脑组织空泡样病变、神经元大量的死亡以及胶质细胞的增多。目前的研究表明该疾病的致病原为朊病毒(PrPsc),它是通过正常细胞膜蛋白朊蛋白(PrPc)二级结构的改变所导致的。线粒体是一种高度动态变化的细胞器,它通过大量多种GTP酶的调节不断完成自身的分裂及融合,为细胞行使正常生理功能提供相应的能量。反之,线粒体分裂融合功能紊乱会引起大量神经元的死亡,最终诱发神经退行性疾病,如帕金森综合症(PD),阿尔茨海默病(AD),亨廷顿病(HD)等。GTP酶家族中Dynamin-likeprotein 1(DLP1)是细胞内起主要作用的线粒体分裂蛋白,在所有的真核生物中序列非常保守并且广泛分布。本研究使用Prion动物模型及细胞模型,探索DLP1调节的线粒体动力学变化与Prion疾病中神经元大量丧失及神经退行之间的关系。并为探索一种新型治疗Prion疾病的药物寻找一个靶点。研究结果发现;1.Prion疾病中神经元及N2a细胞线粒体动力学失衡及线粒体DLP1含量升高:PrP106-126处理的N2a细胞及Prion仓鼠动物模型中,线粒体形态发生改变—碎裂,线粒体脊结构不完整;并且线粒体在神经元内的分布发生了明显的变化:从均匀的分布在细胞体及细胞突中转变到集中于细胞体内分布;Prion疾病中在线粒体DLP1蛋白含量升高:在PrP106-126处理的N2a细胞及Prion仓鼠动物模型中,DLP1的表达量略微降低,但线粒体上DLP1的量却显著升高。2.Prion疾病中线粒体形态及功能的变化是由DLP1调节的:通过对于DLP1量的调控(过表达及RNAi技术)观察线粒体形态的改变,研究发现在PrP106-126处理的N2a细胞中DLP1的过表达可以产生类似PrP106-126处理的N2a细胞中线粒体形态学的变化;DLP1 RNAi可有效的抑制PrP106-126处理后细胞线粒体碎裂的现象;DLP1调节的线粒体碎裂引起Prion疾病中线粒体功能紊乱:在PrP106-126处理的N2a细胞中,线粒体膜电位及ATP下降,活性氧和ADP/ATP上升,DLP1RNAi可有效的缓解PrP106-126处理的N2a细胞中线粒体功能紊乱。3.DLP1调节的线粒体碎裂导致了 Prion疾病中神经元活性的降低、凋亡及突触可塑性:进一步的研究发现,在PrP106-126处理的N2a细胞活性活性明显降低,体内及体外实验证明剪切后Caspase3的量明显升高,细胞发生凋亡。DLP1RNAi可有效的抑制Prion疾病中细胞的活性及凋亡指数;DLP1调节的线粒体碎裂与Prion疾病中神经可塑性有关。通过对N2a细胞及Prion仓鼠模型内PSD95及树突棘蛋白的检测,原代神经元内树突棘及线粒体的共定位结果共同证明,DLP1调节的线粒体形态及分布是Prion疾病中突触损伤及神经退行的原因之一。综上所述,本研究证明了 Prion疾病中,DLP1调控的线粒体动力学失衡和线粒体功能障碍是导致Prion疾病中神经元丧失及退行性病变的原因之一。
【学位单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
中英文缩略词表
第一章 引言
1.1 传染性海绵状脑病概述
1.2 人克雅氏疾病
1.2.1 克雅氏疾病的流行病学
1.2.2 变异型克雅氏病的传播方式
1.2.3 Prion疾病跨种间传播的研究
1.3 病原学特点
1.3.1 朊蛋白低聚物的研究进展
1.3.2 不同种属来源的朊病毒易感性及结构稳定性之间的差异
1.4 PRPC的生物学功能
1.4.1 朊蛋白低聚物的神经毒性
1.4.2 朊蛋白低聚物能够引起神经元的凋亡
1.5 线粒体动力学
1.5.1 线粒体动力学概念
1.5.2 线粒体动力学与神经系统疾病
1.5.3 神经退行性疾病中线粒体动力学的失衡
1.5.4 线粒体动力学调节线粒体功能及凋亡
1.5.5 线粒体动力学与神经系统的发育
1.5.6 线粒体动力学与细胞凋亡
1.5.7 线粒体动力学与突触可塑性
1.6 本研究的目的和意义
第二章 PRION疾病中线粒体形态及分布发生改变
引言
2.1 材料
2.1.1 细胞及实验动物
2.1.2 主要试剂
2.1.3 实验所用溶液的配制
2.1.4 主要仪器及设备
2.2 实验方法
2.2.1 无内毒素质粒Mito-GFP的大量提取
2.2.2 Mito-GFP质粒转染N2a细胞
106-126处理神经元'> 2.2.3 PrP106-126处理神经元
2.2.4 免疫荧光检测Mito-GFP的定位
2.2.5 Prion仓鼠脑组织样本的制备
2.2.6 透射电镜观察Prion金黄地鼠脑内线粒体形态
2.2.7 免疫组织化学染色法检测prion地鼠脑组织线粒体在神经元中的分布情况
2.2.8 统计学分析
2.3 实验结果
106-126处理的N2a细胞线粒体发生碎裂'> 2.3.1 PrP106-126处理的N2a细胞线粒体发生碎裂
2.3.2 prion仓鼠模型脑中线粒体发生碎裂
106-126处理的N2a细胞线粒体分布发生改变'> 2.3.3 PrP106-126处理的N2a细胞线粒体分布发生改变
2.3.4 prion仓鼠模型脑中线粒体分布发生改变
2.4 讨论
第三章 PRION疾病中线粒体DLP1含量的升高导致了线粒体形态及功能的改变
引言
3.1 材料
3.1.1 细胞系及实验动物
3.1.2 主要试剂
3.1.3 实验所用溶液的配制
3.1.4 主要仪器及设备
3.2 实验方法
106-126处理N2a细胞'> 3.2.1 PrP106-126处理N2a细胞
3.2.2 Prion仓鼠脑组织样本的制备
3.2.3 线粒体的分离
3.2.4 Western blot检测目的蛋白
3.2.5 无内毒素重组质粒PCMV-HA-DLP1,Mito-GFP的大量提取
3.2.6 PCMV-HA-DLP1质粒及DLP1RNAi转染N2a细胞
3.2.7 激光共聚焦检测
3.2.8 活性氧的测定
3.2.9 ATP的检测
3.2.10 统计学分析
3.3 结果
3.3.1 Prion疾病中DLP1表达量略有下降
3.3.2 Prion疾病中线粒体DLP1的量显著上升
106-126 N2a细胞中线粒体形态的改变'> 3.3.3 DLP1的量调控了PrP106-126 N2a细胞中线粒体形态的改变
106-126处理的N2a细胞线粒体功能紊乱'> 3.3.4 DLP1调节的线粒体形态的改变可抑制PrP106-126处理的N2a细胞线粒体功能紊乱
3.4 分析与讨论
106-126诱导的神经元凋亡及突触可塑性的改变'>第四章 DLP1调节PRP106-126诱导的神经元凋亡及突触可塑性的改变
引言
4.1 材料
4.1.1 主要试剂
4.1.2 实验所用溶液的配制
4.1.3 主要仪器及设备
4.2 实验方法
4.2.1 小鼠原代皮质神经元的分离培养
4.2.2 无内毒素重组质粒PCMV-HA-DLP1,Mito-GFP的大量提取
4.2.3 PCMV-HA-DLP1质粒及DLP1RNAi转染N2a细胞
106-126刺激小鼠原代神经元'> 4.2.4 PrP106-126刺激小鼠原代神经元
4.2.5 Western blot检测Caspase3、PSD95及Spinophilin蛋白
4.2.6 慢病毒感染
4.2.7 免疫荧光检测树突棘及线粒体共定位
4.2.8 细胞活力的检测
4.2.9 统计学分析
4.3 实验结果
106-126引起的细胞活性降低'> 4.3.1 抑制DLP1的表达可以减少由于PrP106-126引起的细胞活性降低
106-126引起的细胞凋亡'> 4.3.2 Prion疾病中细胞凋亡上升,DLP1调节的线粒体动力学变化可以调节PrP106-126引起的细胞凋亡
4.3.3 DLP1与突触可塑性
4.3.4 Prion疾病中原代神经元树突棘数量的减少是DLP1调节的线粒体动力学紊乱导致的
4.4 分析与讨论
第五章 结论及创新点
5.1 结论
5.2 创新点
参考文献
致谢
个人简介
【参考文献】
本文编号：2843605
【学位单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
中英文缩略词表
第一章 引言
1.1 传染性海绵状脑病概述
1.2 人克雅氏疾病
1.2.1 克雅氏疾病的流行病学
1.2.2 变异型克雅氏病的传播方式
1.2.3 Prion疾病跨种间传播的研究
1.3 病原学特点
1.3.1 朊蛋白低聚物的研究进展
1.3.2 不同种属来源的朊病毒易感性及结构稳定性之间的差异
1.4 PRPC的生物学功能
1.4.1 朊蛋白低聚物的神经毒性
1.4.2 朊蛋白低聚物能够引起神经元的凋亡
1.5 线粒体动力学
1.5.1 线粒体动力学概念
1.5.2 线粒体动力学与神经系统疾病
1.5.3 神经退行性疾病中线粒体动力学的失衡
1.5.4 线粒体动力学调节线粒体功能及凋亡
1.5.5 线粒体动力学与神经系统的发育
1.5.6 线粒体动力学与细胞凋亡
1.5.7 线粒体动力学与突触可塑性
1.6 本研究的目的和意义
第二章 PRION疾病中线粒体形态及分布发生改变
引言
2.1 材料
2.1.1 细胞及实验动物
2.1.2 主要试剂
2.1.3 实验所用溶液的配制
2.1.4 主要仪器及设备
2.2 实验方法
2.2.1 无内毒素质粒Mito-GFP的大量提取
2.2.2 Mito-GFP质粒转染N2a细胞
106-126处理神经元'> 2.2.3 PrP106-126处理神经元
2.2.4 免疫荧光检测Mito-GFP的定位
2.2.5 Prion仓鼠脑组织样本的制备
2.2.6 透射电镜观察Prion金黄地鼠脑内线粒体形态
2.2.7 免疫组织化学染色法检测prion地鼠脑组织线粒体在神经元中的分布情况
2.2.8 统计学分析
2.3 实验结果
106-126处理的N2a细胞线粒体发生碎裂'> 2.3.1 PrP106-126处理的N2a细胞线粒体发生碎裂
2.3.2 prion仓鼠模型脑中线粒体发生碎裂
106-126处理的N2a细胞线粒体分布发生改变'> 2.3.3 PrP106-126处理的N2a细胞线粒体分布发生改变
2.3.4 prion仓鼠模型脑中线粒体分布发生改变
2.4 讨论
第三章 PRION疾病中线粒体DLP1含量的升高导致了线粒体形态及功能的改变
引言
3.1 材料
3.1.1 细胞系及实验动物
3.1.2 主要试剂
3.1.3 实验所用溶液的配制
3.1.4 主要仪器及设备
3.2 实验方法
106-126处理N2a细胞'> 3.2.1 PrP106-126处理N2a细胞
3.2.2 Prion仓鼠脑组织样本的制备
3.2.3 线粒体的分离
3.2.4 Western blot检测目的蛋白
3.2.5 无内毒素重组质粒PCMV-HA-DLP1,Mito-GFP的大量提取
3.2.6 PCMV-HA-DLP1质粒及DLP1RNAi转染N2a细胞
3.2.7 激光共聚焦检测
3.2.8 活性氧的测定
3.2.9 ATP的检测
3.2.10 统计学分析
3.3 结果
3.3.1 Prion疾病中DLP1表达量略有下降
3.3.2 Prion疾病中线粒体DLP1的量显著上升
106-126 N2a细胞中线粒体形态的改变'> 3.3.3 DLP1的量调控了PrP106-126 N2a细胞中线粒体形态的改变
106-126处理的N2a细胞线粒体功能紊乱'> 3.3.4 DLP1调节的线粒体形态的改变可抑制PrP106-126处理的N2a细胞线粒体功能紊乱
3.4 分析与讨论
106-126诱导的神经元凋亡及突触可塑性的改变'>第四章 DLP1调节PRP106-126诱导的神经元凋亡及突触可塑性的改变
引言
4.1 材料
4.1.1 主要试剂
4.1.2 实验所用溶液的配制
4.1.3 主要仪器及设备
4.2 实验方法
4.2.1 小鼠原代皮质神经元的分离培养
4.2.2 无内毒素重组质粒PCMV-HA-DLP1,Mito-GFP的大量提取
4.2.3 PCMV-HA-DLP1质粒及DLP1RNAi转染N2a细胞
106-126刺激小鼠原代神经元'> 4.2.4 PrP106-126刺激小鼠原代神经元
4.2.5 Western blot检测Caspase3、PSD95及Spinophilin蛋白
4.2.6 慢病毒感染
4.2.7 免疫荧光检测树突棘及线粒体共定位
4.2.8 细胞活力的检测
4.2.9 统计学分析
4.3 实验结果
106-126引起的细胞活性降低'> 4.3.1 抑制DLP1的表达可以减少由于PrP106-126引起的细胞活性降低
106-126引起的细胞凋亡'> 4.3.2 Prion疾病中细胞凋亡上升,DLP1调节的线粒体动力学变化可以调节PrP106-126引起的细胞凋亡
4.3.3 DLP1与突触可塑性
4.3.4 Prion疾病中原代神经元树突棘数量的减少是DLP1调节的线粒体动力学紊乱导致的
4.4 分析与讨论
第五章 结论及创新点
5.1 结论
5.2 创新点
参考文献
致谢
个人简介
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 Zhiqi Song;Deming Zhao;Lifeng Yang;;Metabolism of minor isoforms of prion proteins Cytosolic prion protein and transmembrane prion protein[J];Neural Regeneration Research;2013年30期
本文编号：2843605
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/2843605.html
