两种H1N1亚型猪流感基因工程疫苗的制备及免疫效果评价

发布时间：2020-10-16 19:59

　　 猪流感是由猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)引起的一种急性、热性、高度传染性呼吸系统疾病。猪流感病毒亚型众多,变异速度快,广泛流行于包括我国在内的世界各地养殖场猪群中,给全球养殖业带来了巨大的经济损失。目前疫苗接种仍是防控猪流感的最有效手段。在保证疫苗安全性的前提下,为了提高猪流感疫苗的保护效果,本研究分别制备了表达SIV血凝素(HA)基因的活病毒载体疫苗r SMX?TK?g I/g E-opti HA和利用杆状病毒表达系统表达并纯化的HA蛋白制备的亚单位疫苗,并对两者的单独及联合免疫效果进行初步研究。通过将两种疫苗单独或配合使用,测定各组体液免疫和细胞免疫水平、攻毒后的病理损伤情况、体重丢失以及存活率等方面来比较不同免疫策略下保护效果的差异,以期找到免疫效果最佳的疫苗组合,为猪流感疫苗的研发提供可靠的数据支持。本研究主要内容如下:1.表达SIV HA基因的重组变异伪狂犬病病毒r PRV-HA的制备本研究以变异伪狂犬病病毒基因缺失毒株(r SMX?g I/g E?TK)为载体,以密码子优化的H1N1亚型猪流感病毒HA基因为目的基因,采用同源重组的方法,成功构建了重组病毒r SMX?TK?g I/g E-opti HA,并对获得的重组病毒在多种细胞上的增殖特性、一步生长曲线、遗传稳定性以及对小鼠的安全性等生物学特性进行了研究。结果表明,r SMX?TK?g I/g E-opti HA能够稳定表达HA蛋白。该重组病毒在ST、PK-15、Vero和BHK-21细胞上的毒价均高于107.0 TCID50/0.1 m L,并且在PK-15细胞上的毒价达108.0 TCID50/0.1 m L。一步生长曲线结果表明,该重组病毒的增殖特性与亲本毒株一致。连续传代20代后,HA基因未发生变异,表明该重组病毒具有良好的遗传稳定性,并且对小鼠安全性良好。2.HA蛋白亚单位疫苗的制备本研究采用经典的Bac-to-Bac杆状病毒真核表达系统,表达HA蛋白。将SIV HA基因的信号肽及胞外域片段克隆到转移载体p Fast Bac HT B中,获取重组质粒p Fast Bac HT B-HA。将鉴定正确的重组质粒p Fast Bac HT B-HA转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经三次蓝白斑筛选得到含HA基因的重组杆状病毒质粒r Bacmid-HA。随后,将重组杆粒r Bacmid-HA转染至sf9昆虫细胞中,获得重组杆状病毒r Ac MNPV-HA,传代3次后,用sf9细胞进行重组蛋白的优化表达。SDS-PAGE和Wstern blotting结果显示,重组蛋白在培养上清和细胞内均表达,且培养上清中的蛋白,即分泌蛋白均以糖基化形式存在;而在细胞内表达的蛋白多以非糖基化形式存在。3.两种猪流感基因工程疫苗单独及联合免疫效果研究在成功制备了活病毒载体疫苗r SMX?g I/g E?TK-opti HA和HA蛋白亚单位疫苗的基础上,本研究将4周龄健康雌性BLAB/c小鼠随机分为8组,其中3个实验组和5个对照组,每组10只,空白对照组(非免疫不攻毒)每组5只。采取皮下注射的免疫方式进行r SMX?TK?g I/g E-opti HA活病毒载体疫苗的单独免疫、HA蛋白亚单位疫苗的单独免疫以及r SMX?TK?g I/g E-opti HA活病毒载体疫苗和HA蛋白亚单位疫苗的联合免疫,同时设置亲本病毒载体对照组,DMEM对照组、佐剂对照组、灭活疫苗对照组以及空白对照组(详细分组见表3-6)。每组共免疫2次,间隔4周。分别在首免后第0、2、4和6周采血检测SIV ELISA抗体、PRV ELISA抗体、SIV HI抗体以及细胞因子IFN-γ,并于加强免疫2周后,在乙醚麻醉下,用H1N1(F9)(LD50为102.38 TCID50)通过滴鼻方式进行攻毒,剂量为50ul/只。攻毒后连续14 d每日称量每只小鼠的体重,并观察小鼠临床表现及统计死亡情况。结果显示,r SMX?TK?g I/g E-opti HA活病毒载体疫苗单独免疫、HA蛋白亚单位疫苗的单独免疫以及两种疫苗联合免疫均能够刺激小鼠产生特异性体液免疫应答及细胞免疫应答;r SMX?TK?g I/g E-opti HA的单独免疫效果最佳但低于SIV灭活疫苗对照组。攻毒保护力试验结果表明,两种疫苗单独及联合免疫对小鼠均有较好的保护力,保护率分别为85.7%、85.7%和71.4%,PBS对照组存活率仅42.9%。r SMX?TK?g I/g E-opti HA的单独免疫与两种疫苗联合免疫保护力相当,且高于HA亚单位疫苗的单独免疫。因此,从本研究结果可以初步判定r SMX?TK?g I/g E-opti HA单独免疫具有最佳的免疫保护效果。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.52
【部分图文】：

图 3-2 重组病毒 rSMX TK gI/gE-optiHA 的构建示意图Figure. 3-2 The construction of rSMX TK gI/gE-optiHA3.2.2.2 重组病毒 rSMX gI/gE TK-optiHA 的 Western Blotting 和 IFA 鉴定SDS-PAGE 与 Western blotting：(1) 蛋 白 样 品 的 制 备 ： 将 亲 本 株 rSMX TK gI/gE 及 重 组 病 毒rSMX TK gI/gE-optiHA 株分别接种 PK-15 细胞，待细胞全部病变时，分别收集细胞和上清，上清先 4 5000 r/min 离心 5-10 min 去除脱落的细胞，再 12000 r/mi离心 1 min 去除细胞碎片等杂质，最后加入 PEG8000 使终浓度为 10%，放在 4 过夜进行蛋白浓缩，次日 12000 r/min 离心 30min，小心弃去上清，加入适量 PBS 重悬即得到浓缩上清样品。向六孔板孔中加入 PBS 清洗细胞 2-3 次，细胞刮刀刮取细胞4 离心 5 min，弃上清，按比例加入蛋白裂解液(含 PMSF)，4 或冰上裂解 30 min4 12000 r/min 离心 5-10 min，取上清即得到细胞裂解上清样品。分别各取 80 μ浓缩上清样品和细胞裂解上清样品，加入 20 μL5×SDS Loading Buffer，用注射器或移液器吹打至不再粘稠，沸水煮样 10 min，冰浴 5 min 后，12000 r/min 离心甩下沉

两种 H1N1 亚型猪流感基因工程疫苗的制备及免疫效果评价4 结果与分析4.1 HA 基因的生物信息学分析经预测，SIV HA 蛋白第 1-17 氨基酸为信号肽区域（图 4-1A），第 543-566 氨基酸为跨膜区（图 4-1B）。武瑞静的研究表明流感病毒可以通过自身的血凝素蛋白信号肽实现分泌表达(武瑞静 2012)，所以本研究选用了自身的信号肽，并参考Masaru Kanekiyo 等的实验设计将表达区域确定为 HA 去除跨膜区和胞内区的 HA1和 HA2 基因（1-518 氨基酸）。经预测，目的蛋白的大小约 58 kD，等电点为 6.74（图 4-1C）。

gI/gE-optiHA 的构建及鉴定SMX TK gI/gE-EGFP 和 rSMX TK gI/gE-oEGFP质粒与rSMX gI/gE TK基因组采用常程中未采集图片），然后用转染液进行空斑过 5 轮纯化后，获得纯化好的重组病毒 rS重组病毒 rSMX TK gI/gE-EGFP 构建完成瓶传代 3 次，每代次都进行荧光观察，没有提基因组，准备下一轮转染，用目的基因把 图 4-2 转移质粒鉴定结果Fig. 4-2 PCR identification of transfer plasmA:PCR identification of pcaggs-LR-EGFPB:PCR identification of pcaggs-LR-optiHAM:DL15 000 DNA Marker；Lane 1-4: Recombinant plaLane 5:Negative control
【参考文献】

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本文编号：2843710