两株低致病性禽流感病毒的分离鉴定及生物学特性研究

发布时间：2020-10-16 20:52

　　 禽流感(Avian influenza,AI)是由禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)引起的可以发生高度接触性传染病。目前发现HA共有18种亚型(H1-H18),NA共有11种亚型(N1-N11),HA和NA亚型的组合形成不同亚型的禽流感病毒。根据对动物的致病性强弱,禽流感被分为三种,分别是高致病性禽流感(Highly Pathogenic Avian Influenza,HP-AI)、中等致病性禽流感(Mildly Pathogenic Avian Influenza,MP-AI)和低致病性禽流感(Lowly Pathogenic Avian Influenza,LP-AI)。我国的第一例H9N2亚型禽流感病毒的疫情是在1994年报道的,随后在我国各地均有H9N2禽流感疫情报道。H9N2毒株并不表现出明显的临床症状,但在感染宿主后,能够持续对外排毒,对禽流感的防控工作增加了难度。本试验为禽流感病毒的防控提供了一定的理论基础。1.禽流感病毒的分离与鉴定本次试验从湖北省荆门、大冶两个地区的大型养鸡场采集病料,目前是采用鸡胚注射的方法来增殖病毒。在接种9-10日龄的SPF鸡胚尿囊腔后,收集含有病毒的尿囊液并进行一系列的试验,如血凝试验、血凝抑制试验等,筛选到了两株禽流感病毒。并通过试验手段进行亚型鉴定,确定两株病毒均属于H9N2亚型禽流感病毒。根据流感病毒命名的标准体系分别命名为A/chicken/Daye/DY0602/2017(简称DY0602)和A/chicken/Jinmen/JM0305/2017(简称JM0305)。对这两株H9亚型禽流感病毒进行血凝特性、EID_(50)(鸡胚半数感染量)、MDT(鸡胚最小致死量的平均致死时间)、ICPI(脑内致病指数)等相关性试验进行生物学特性的研究。两株H9亚型禽流感病毒DY0602、JM0305的生物学特性符合禽流感病的基本特征,其EID_(50)分别为10~(-8.42)EID_(50)/0.1ml、10~(-7.42)EID_(50)/0.1ml;MDT值分别为72h、91h;ICPI值均为0。2.禽流感病毒的全基因组测序及分析为了进一步了解从养鸡场的病鸡体内所分离到的两株H9N2亚型禽流感病毒的分子流行特征,首先进行了全基因组序列的测定,获得序列后进行对比分析,并上传至NCBI,获得登录号。其次进行比较和分析两株H9N2亚型禽流感病毒与NCBI已上传的各个分支的代表毒株两者之间的序列同源性关系、HA和NA这两种氨基酸蛋白的裂解位点、受体结合位点以及系统进化分析。这两个毒株的PB2,PB1,PA,HA,NP,NA,M,NS基因的开放阅读框分别由2280,2274,2151,1683,1497,1401,759,366个碱基组成,分别编码759,757,716,560,498,466,252/97,121氨基酸残基。这两株病毒HA的裂解位点具有低致病性禽流感病毒的典型特征,均为RSSR/GLF。这两株H9亚型禽流感病毒均处在欧亚分支中的CK-BJ-like亚分支。3.禽流感病毒对鹌鹑的致病性研究为进一步了解H9N2亚型的低致病性禽流感病毒的生物学特性,我们通过试验将分离到的两株H9N2亚型禽流感病毒人工感染4周龄鹌鹑,并在感染的24h后放入同居鹌鹑,检测其临床症状、排毒情况、血清抗体转阳、脏器组织学变化,进而观察H9N2亚型禽流感病毒对鹌鹑的致病性及其接触传播能力。结果显示:两株H9亚型禽流感病毒感染宿主后均能通过喉头和泄殖腔排毒,虽然不会引起鹌鹑明显的临床症状及死亡,但在做病理切片分析发现在各个脏器中均有不同程度的病变。在感染的第7d、第14d均可以检测血清抗体转阳。表明两株H9N2亚型禽流感病毒在鹌鹑群中具有良好的水平传播能力。近些年来,由于人类对生态环境的改变,也导致自然界中病毒通过自身的变异去适应环境的改变。禽流感病毒不断的变异也给我国在禽流感的防控方面带来了极大的困难。本研究进行禽流感病毒地方流行株的分离鉴定及部分生物学特性研究,旨在了解湖北及周边省市AIV的流行情况及毒株特征。同时,本研究完成鸡源JM0305株、DY0602株的全基因组序列测定与分析,初步了解鸡源AIV的致病特点和探索毒株对其他物种的影响。另外,两株分离株对鹌鹑的致病性试验也为鹌鹑疫病防控提供了一定的理论基础。
【学位单位】：中南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

使病毒不具有血凝活性。根据流感病毒命名的标准体系分n/Jinmen/JM0305/2017（简称 JM0305）和 A/chicken/Daye/DY0602/2）。表 2.6 HA 及 HI 试验结果Table2.6 The result of HA and HI tests HA 效价（log2）HI 效价（log2）H9 H7 H5 ND 7 8 0 0 08 8 2 0 002、JM0305 分离株 PCR 结果： 产物通过琼脂糖凝胶电泳试验验证，得到片段的大小与预期相同，大.1。

图 2.2 鸡胚感染 H9N2 禽流感病毒的临床症状ig.2.2 chicken embryos infected with the isolated H9N2 A1.JM0305; 2.DY0602; 3、4.阴性对照0305 对 1 日龄鸡脑内致病指数（ICPI）的测定结果：染 1 日龄的 SPF 鸡后，通过观察发现并没有出现任何本试验结果也符合国际通用标准规定低致病力毒株的方法有很多，一般常用的几种技术手段为病毒分离、血等。目前禽流感病毒的培养宿主通常是使用 9-11 日龄过观察 DY0602、JM0305 两株分离株感染 SPF 鸡、H验的两株 H9 亚型禽流感病毒均属于低致病性禽流感病

M. DNA 标准 DL2000; A. JM0305; B. DY0602M. DNA Marker DL 2000; A.JM0305; B.DY0602图 3.1 H9N2 禽流感病毒 8 个基因节段 PCR 扩增图Fig.3.1 The electrophoresis results of amplification of 8 Fragments of H9N2 subtype AIV3.3.2 全基因组的测序及序列分析3.3.2.1 全基因组的序列分析结果将扩增并经鉴定后的 PCR 产物送至生物工程（上海）股份有限公司测序后，将公司反馈的结果通过 DNAstar4.0 分析软件处理，得到全基因组的完整 ORF 序列，并上传至NCBI，获得登陆号如表 3.7 所示。表 3.7 JM0305、DY0602 分离株全基因组 8 基因片段的核苷酸序列分析Table 3.7 The genome characteristics of the JM0305、DY0602 isolated virus strains
【参考文献】

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本文编号：2843762