p53对口蹄疫病毒复制及致病性的影响

发布时间：2020-10-17 09:35

　　 【目的】本研究利用shRNA技术敲低p53、利用CRISPR/cas技术敲除Tp53,并利用外源过表达质粒上调p53等方法,通过构建Tp53基因敲除(Tp53~(-/-))细胞系、培育Tp53基因敲除C57BL/6小鼠,旨在揭示p53在FMDV复制及对小鼠致病性中的生物学功能。【方法】(1)用FMDV处理PK-15细胞(porcine kidney 15 cell line)1h,用RNA-seq方法分析并用RT-qPCR(real-time quantitative polymerase chain reaction)验证以揭示宿主为对抗FMDV感染的早期反应表达谱;(2)以BHK-21与PK-15细胞为材料,用MG132与MDM2抑制剂等药物对细胞进行预处理,再用RT-qPCR与WB(western blotting)方法检测FMDV感染与未感染细胞中p53在mRNA和蛋白水平的表达,确定FMDV对BHK-21与PK-15细胞中p53的影响及相应通路;(3)利用shRNA(short hairpin RNA)技术敲低BHK-21细胞中Tp53基因的表达,然后用FMDV对细胞进行处理,研究p53表达下调对FMDV复制的影响;(4)将构建并测序鉴定的Tp53基因过表达质粒HA-Tp53与Flag-Tp53转入BHK-21细胞中,WB方法确定p53表达上调后用FMDV进行处理,检测外源p53过表达质粒对FMDV复制的影响;(5)利用CRISPR/cas9系统构建Tp53~(-/-)的BHK-21和PK-15细胞系并用WB与测序方法进行鉴定,然后,利用敲除成功的细胞系研究p53对FMDV在BHK-21和PK-15细胞中复制的影响;(6)利用购买并繁育的Tp53~(-/-)的C57BL/6小鼠,研究FMDV对WT(wild type)与Tp53~(-/-)小鼠致死性;(7)利用生理盐水、轻揉震荡法分离WT与Tp53-/-小鼠腹腔巨噬细胞(rat peritoneal macrophages,RPMφ),培养贴壁后进行FMDV进行处理,用RT-qPCR方法检测各细胞因子的表达情况;(8)1月龄WT与Tp53-/-小鼠分别用FMDV(100LD_(50))处理72h,然后取心脏、脾脏和肌肉固定于4%多聚甲醛中,然后用HE染色方法分析Tp53基因敲除对FMDV致病性的影响。【结果】(1)经RNA-seq分析及RT-qPCR验证,PK-15细胞经FMDV处理1h时上调TNF、CXCL2、CCL20、CCL4和IL6等细胞因子以刺激炎症反应来对抗FMDV感染;(2)MG132实验表明FMDV感染1h内通过泛素化通路抑制细胞p53在mRNA与蛋白水平的表达,再经MDM2抑制剂处理后发现,FMDV在感染早期是通过非MDM2依赖的泛素化途径抑制BHK-21中p53的表达;(3)shRNA敲低Tp53基因的表达能够抑制FMDV在BHK-21细胞中的复制;(4)外源HA-Tp53与Flag-Tp53过表达质粒上调p53表达后不能显著影响FMDV在BHK-21细胞中的复制情况;(5)利用CRISPR/cas9系统成功获得Tp53~(-/-)的BHK-21与PK-15细胞系,且发现在Tp53~(-/-)细胞系中FMDV复制受到抑制。此外,MDA5、RIG-I、TLR3在Tp53~(-/-)细胞系中被上调;(6)相比于WT型C57BL/6小鼠,Tp53敲除小鼠在FMDV感染时存活率更高;(7)分离小鼠腹腔巨噬细胞并用FMDV感染,结果表明Tp53基因的敲除使IFNB-1、TNF、IL-6等发挥主要抗病毒功能的细胞因子表达被上调;(8)HE病理切片结果显示,与Tp53~(-/-)小鼠相比,FMDV对WT小鼠的病理损伤更严重。【结论】在感染早期,FMDV经非MDM2特异性泛素化-蛋白酶体途径抑制p53的表达,而宿主主要以炎症反应抵抗感染;长期感染中,p53的敲除使IFNB-1、IRF-3、ISRE、TNF、IL6、RIG-I、MDA-5等的表达上调从而抑制FMDV的复制及其对小鼠的致病性。
【学位单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

的疫苗接种对其他血清型几乎没有交叉保护作用。因此，选择正确的疫苗来控制每至关重要[27]。蹄疫病毒（FMDV）概述口蹄疫病毒（FMDV）属于小 RNA 病毒科中的口蹄疫病毒属，并且具有直链 22 至 单股正链，非包膜 RNA 基因组。它因为病毒 RNA 依赖性 RNA 聚合酶缺乏校对能有高突变率[28]。因其具有较高的传染率和实行国际贸易限制，口蹄疫被世界动物织（国际动物卫生组织（OIE））规定为动物必报疫病[18]。在牛犊、羊羔、小孩以中，FMDV 诱导的心肌损伤可能导致在任何囊泡发育前发生死亡[29]。FMDV 的基度超过 8000 个碱基，在其 5'-末端共价结合 23/24 氨基酸残基基因组连锁蛋白 3B[30]因组含有一个长的开放阅读框（ORF），其有两个不同的起始位点，并且它编码的多可以被转变为十几个成熟多肽以及多种部分切割的中间体[31-34]。该多聚蛋白裂解成 3 种病毒结构蛋白（VP0，VP3，VP1）以及 8 种非结构蛋白(L，2A，2B，2C，3A3C 和 3D)（见图 1.1）。3C 蛋白酶是一种小 RNA 病毒的通用裂解酶。FMDV 衣壳前 可被 3C 蛋白酶切割，产生 VP0，VP3，VP1 和 2A[35]。

图 1.3 p53 参与的细胞过程（引自 CJ Sherr 等）Fig. 1.3 p53 participated cellular processes (CJ Sherr, et al)2 负反馈调节自身稳定性；通过 Puma、Noxz、 BAX 参与凋亡调控；由 p21 等介导细介导参与衰老调控；通过 Ercc5、Mgmt 等参与 DNA 损伤修复；通过 TIGAR 参与新陈他因子介导的细胞过程。its own stability through negative feedback of MDM2; Puma, Noxz, BAX participate in apoptoregulated by p21; senescence regulation is regulated by PML and PAI-1; participating repair of, Mgmt, etc.; involvement in metabolism through TIGAR; and other factor-mediated cellular p

图 1.4 p53 的信号通路（引自 BioCarta）Fig. 1.4 p53 Signaling Pathway (information provided by BioCarta)到损伤刺激时，p53 被磷酸化进入细胞核参与 GADD45、IGFBP3、BAX、p21 等介导的细胞周期阻滞列细胞活动。发挥玩功能后，为了维持其稳定性，MDM2 等一系列细胞因子介导 p53 出核转运并进蛋白酶体降解途径。lls are stimulated by injury, p53 is phosphorylated into the nucleus and participates in a series of cell activi, IGFBP3, BAX, p21 and other cell cycle arrest and DNArepair. In order to maintain its stability, a series osuch as MDM2 mediate p53 nuclear transport and enter the ubiquitination-proteasome degradation pathwa
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本文编号：2844607