外源褪黑素对超低温冷冻小鼠成熟卵母细胞发育潜力的影响

发布时间：2020-10-18 05:51

　　 本实验旨在探讨不同浓度外源褪黑素对冷冻后卵母细胞发育能力的影响。首先,小鼠MⅡ期卵母细胞采用OPS法玻璃化冷冻保存,解冻后在含不同浓度(0mol/L,10-9 mol/L,10-7 mol/L,10"5 mol/L,10-3 mol/L)褪黑素的M2液中培养1h,然后检测卵母细胞中ROS和GSH水平,孤雌激活后的胚胎发育能力和囊胚细胞数；并检测了3组不同浓度(0 mol/L,10-7 mol/L,1O-3 mol/L)的褪黑素处理后的卵母细胞内5种基因(Hsp90aal, Hsfl, Hspa1b, Nrf2和Bcl-xl)的mRNA表达水平。结果如下：(1)玻璃化冷冻解冻后的卵母细胞在含褪黑素的M2液中培养1 h,ROS水平只有10-3 mol/L褪黑素添加组显著低于未添加组(P0.05),GSH水平在所有添加褪黑素组与未添加组之间无显著差异(P0.05)。(2)玻璃化冷冻解冻后的卵母细胞在含褪黑素的M2液中培养1 h,经孤雌激活,孤雌激活胚发育到2-细胞胚胎的能力随着添加褪黑素的浓度增加而降低,而10-9～10-5 mol/L的褪黑素添加组与未添加组无显著差异(P0.05),只有10-3 mol/L添加组卵裂率显著低于未添加组(P0.05)；孤雌激活胚发育到囊胚的能力不随添加褪黑素的浓度增加而改变(P0.05)。囊胚细胞数随添加褪黑素的浓度增加而降低,但差异不显著(P0.05)。(3)实时荧光定量PCR研究结果发现,10-3 mol/L和10-7 mol/L褪黑素添加组与未添加组都能检测到Hsp90aal, Hsfl, Hspa1b, Nrf2和Bcl-xl的表达。10-3 mol/L的添加组5种基因的表达量都比未添加组低,且Hsf1、Hsp90aa1和Bcl-xl差异显著；且与10-7 mol/L的添加组相比,Hsp90aa1和Bcl-xl差异也显著。10"7 mol/L的添加组与未添加相比,Hspa1b和Hsf1表达量稍低,差异不显著(P0.05)；Nrf2、Hsp90aa1和Bcl-xl表达量上调,但只有Hsp90aal差异显著(P0.05)。(4)体外受精实验表明,冷冻会使卵母细胞的卵裂率和囊胚率显著低于新鲜组(Fresh)(P0.05),添加10-7 mol/L的褪黑素对卵母细胞的卵裂率和囊胚率没有影响(P0.05)。因此,小鼠MⅡ期卵母细胞超低温冷冻解冻后培养1h添加的不同浓度的(10-9, 10-7,10-5,10-3 mol/L)褪黑素,对卵母细胞的后续发育能力没有明显改善。
【学位单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S814
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文符号说明
1 文献综述
    1.1 褪黑素在动物配子发生与胚胎发育中的作用
        1.1.1 哺乳动物松果体中褪黑素的生物合成和释放
        1.1.2 褪黑素受体及信号转导过程
        1.1.3 褪黑素在动物生殖中作用
        1.1.4 褪黑素有利于精子发生及异常条件下的损伤修复
        1.1.5 褪黑素可促进卵母细胞成熟与发育
        1.1.6 褪黑素可提高早期胚胎发育质量
    1.2 哺乳动物卵母细胞超低温冷冻保存
        1.2.1 卵母细胞冷冻的意义
        1.2.2 卵母细胞的玻璃化冷冻
        1.2.3 卵母细胞冷冻损伤及解决措施
    1.3 褪黑素在缓解卵母细胞超低温冷冻损伤方面存在潜在价值
    1.4 本实验的目的意义
2 材料方法
    2.1 实验动物
    2.2 试剂和仪器设备
        2.2.1 主要试剂
        2.2.2 主要仪器设备
        2.2.3 溶液配制
    2.3 实验方法
        2.3.1 卵母细胞收集
        2.3.2 卵母细胞玻璃化冷冻和解冻
        2.3.3 小鼠附睾精子采集和体外受精
        2.3.4 ROS和GSH检测
        2.3.5 卵母细胞激活和胚胎培养
        2.3.6 囊胚细胞计数
        2.3.7 定量PCR
        2.3.8 统计分析
3 结果与分析
    3.1 褪黑素添加与冷冻小鼠卵母细胞的氧化还原状态
    3.2 褪黑素添加与冷冻小鼠卵母细胞孤雌激活后的胚胎发育
    3.3 褪黑素添加与冷冻小鼠卵母细胞内基因的表达
    3.4 褪黑素添加与对冷冻小鼠卵母细胞IVF后胚胎的发育
4 讨论
    4.1 褪黑素对冷冻小鼠卵母细胞内ROS的影响
    4.2 褪黑素对冷冻小鼠卵母细胞内GSH的影响
    4.3 褪黑素对冷冻小鼠卵母细胞孤雌激活后胚胎发育的影响
    4.4 褪黑素对冷冻小鼠卵母细胞基因表达的影响
5 结论
参考文献
致谢
附表
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本文编号：2845893